本文選題：布魯氏菌　切入點：THP-1細胞　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2008年碩士論文

【摘要】： 布魯氏菌可引起布魯氏菌病,使大范圍的哺乳動物致病,包括人類和家畜,每年約有500 000人受此病困擾,在很大程度上影響民生的需求,同時也在相當程度上影響畜牧業(yè)的發(fā)展,影響國際貿易及旅游事業(yè),給人們帶來巨大的經濟損失。布魯氏菌是典型胞內致病菌,與其它胞內寄生菌不同,布魯氏菌不產生外毒素、無抗吞噬莢膜、無入侵酶、無LPS、無毒性質粒、無抗藥性、不發(fā)生抗原變異,其主要的毒力是能侵入巨噬細胞并在其中增殖[1-5]。巨噬細胞作為免疫調節(jié)細胞和效應細胞,可消滅多數(shù)入侵的病原體,并激活宿主特異性和非特異性免疫應答。布魯氏菌之所以能逃脫巨噬細胞的殺傷作用并在巨噬細胞內長期存活有以下策略:(1)迅速從吞噬溶酶體逃脫至細胞質中;(2)抑制吞噬溶酶體的形成;(3)抑制巨噬細胞分泌細胞因子;(4)抑制巨噬細胞的凋亡;(5)抑制巨噬細胞的抗原提呈能力[3-6]。所有這些策略都需要布魯氏菌與巨噬細胞相互作用,巨噬細胞殺菌活性、抗原提呈能力及免疫調節(jié)能力被布魯氏菌抑制的程度決定了布魯氏菌能否繼續(xù)在宿主細胞內存活和繁殖,因此,巨噬細胞早期的免疫應答反應對布魯氏菌的存活和宿主免疫應答的產生起關鍵作用。 然而,目前對巨噬細胞感染過程中的信號轉導途徑和布魯氏菌的毒力策略知之甚少,為了揭示巨噬細胞的免疫監(jiān)視防御機制和布魯氏菌在細胞內的存活機制,解密布魯氏菌-宿主相互作用的機制,本室利用二維電泳技術和質譜學相結合的方法,對布魯氏菌侵襲宿主細胞后的蛋白表達譜進行鑒定,共確定了38個蛋白表達差異點,分別對應38個蛋白質編碼基因。感染性疾病是病原微生物和宿主緊密作用的結果,研究感染過程中宿主的差異表達蛋白不僅有助于理解宿主反應的分子機制和病原微生物的致病機理,還有可能鑒定到新的分子標記物以及藥物靶標,為此本研究結合國外的研究報道,選取其中兩個可能對布魯氏菌侵襲巨噬細胞發(fā)揮作用的差異表達蛋白-CIP29和WDR1進行研究以探討其在布魯氏菌感染巨噬細胞中的可能作用,為布魯氏菌致病機制與巨噬細胞免疫防御機制研究奠定基礎。 目前對CIP29和WDR1的研究很少,生物信息學預測CIP29可能有核苷酸結合能力,參與重要的轉錄后和翻譯后調控,參與新陳代謝,也可能是參與細胞凋亡調控的蛋白之一,在調節(jié)細胞命運的過程中可能起著非常復雜的作用。WDR1含9個WD重復結構域,可促進肌動蛋白的翻轉,參與細胞形態(tài)的調節(jié),參與蛋白-蛋白間的相互作用。布魯氏菌侵襲THP-1細胞后,CIP29和WDR1的表達量發(fā)生明顯改變,故本研究將干預細胞中CIP29和WDR1的表達,研究其對布魯氏菌侵襲和巨噬細胞功能的影響,以揭示感染免疫過程中的關鍵事件,為布魯氏菌的致病機制和巨噬細胞的防御機制研究奠定基礎。 本研究共分兩部分:1、CIP29對布魯氏菌侵襲的影響和其在巨噬細胞中功能的初步研究。(1)通過RT-PCR方法從細胞中獲取CIP29基因片段;(2)構建重組質粒pET28a-CIP29,誘導表達并純化重組蛋白CIP29,免疫動物制備多抗為下一步試驗奠定基礎;(3)構建重組質粒pEGFP-CIP29轉染THP-1細胞上調CIP29在細胞中表達;(4)檢測CIP29對細胞凋亡和分泌TNF-α能力的影響;(5)檢測CIP29對布魯氏菌侵襲THP-1細胞的影響。2、WDR1對布魯氏菌侵襲和巨噬細胞功能的影響的初步研究。(1)通過RT-PCR方法從細胞中獲取WDR1基因片段;(2)構建重組質粒pET28a-WDR1,誘導表達并純化重組蛋白WDR1,免疫動物制備多抗為下一步檢測siRNA干擾效果奠定基礎;(3)設計合成siRNA序列,轉染細胞,下調該蛋白在細胞中的表達;(4)檢測WDR1對布魯氏菌侵襲THP-1細胞的影響;(5)檢測WDR1對巨噬細胞吞噬能力和TNF-α分泌能力的影響。 結果:通過RT-PCR方法成功獲得了CIP29和WDR1基因,并將其構建到表達載體上,制備了重組蛋白CIP29和WDR1以及各自的多克隆抗體;上調CIP29在細胞中的表達后可誘導THP-1細胞凋亡,與對照組差異顯著;CIP29的高表達對TNF-α的分泌水平影響不明顯,對布魯氏菌侵襲細胞的過程略有影響,但無統(tǒng)計學差異。通過RNAi技術下調WDR1的表達后巨噬細胞吞噬能力發(fā)生明顯改變,與對照組差異顯著;WDR1的低表達對巨噬細胞分泌TNF-α的水平和布魯氏菌侵襲細胞的過程無明顯影響。 結論:巨噬細胞防御布魯氏菌的侵襲是多個蛋白共同協(xié)調作用的復雜過程,本文用干預的方法來研究這些差異表達蛋白的功能只是一種最簡單初步的方法,由于各個蛋白的功能不同,要想確切了解其在布魯氏菌感染中的作用,需綜合多種技術手段。在本實驗中,未觀察到CIP29和WDR1在布魯氏菌感染中的非常明確的作用,這是否是由于技術本身的局限性所造成,還是由于單一蛋白本身在調節(jié)布魯氏菌感染過程中的復雜作用使其表現(xiàn)不明顯,其作用還有待用其它的方法進一步驗證。本試驗結果初步說明單一蛋白對布魯氏菌侵襲THP-1細胞的影響可能不顯著,宿主防御布魯氏菌的感染是多種蛋白,多層次協(xié)同作用的結果。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R516;R392

【引證文獻】

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本文編號：1720743