本文選題：肺炎克雷伯菌　切入點：MrkD　出處：《吉林大學》2010年博士論文

【摘要】： 肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.pn)是革蘭氏陰性菌,屬于腸桿菌科克雷伯菌屬,可在全身許多器官引發(fā)感染,但最高的發(fā)病機率在泌尿生殖道和肺部。當機體免疫力下降或者大量長期濫用抗生素引發(fā)菌群失調(diào)時導致感染,可引起腦膜炎、肺炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎、傷口感染甚至敗血癥等,給臨床治療帶來了許多麻煩,治療不好則發(fā)病死亡率極高。雖然抗生素的使用,在目前可以有效治療感染性疾病,可是當感染范圍比較大,藥物產(chǎn)生不良反應、多重耐藥菌株逐年增加,而且停止使用后發(fā)生再次感染等因素,使抗生素治療的臨床使用遇到難題。由于人們對K.pn結構認識的加深,通過疫苗預防來防治K.pn侵襲增加了可行性,對于其疫苗的研究也逐漸升溫,有重要的意義。 本研究首先對肺炎克雷伯菌的粘附素MrkD蛋白是否為主要保護性抗原進行了鑒定。采用原核表達得到純化的粘附素MrkD蛋白,通過激光共聚焦顯微鏡觀察粘附定位,進而通過粘附抑制與粘附動力學試驗證明粘附素MrkD蛋白的粘附阻斷作用,最后通過免疫保護實驗,最終證實了菌毛粘附素MrkD蛋白可以作為肺炎克雷伯菌的主要保護性抗原,可用作進一步的表位疫苗研究。 為獲取用于篩選粘附素MrkD蛋白B細胞表位的單克隆抗體,利用融合蛋白rMrkD作為免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,利用淋巴細胞雜交瘤技術,采用間接ELISA篩選穩(wěn)定分泌針對MrkD蛋白的單克隆抗體。經(jīng)擴大培養(yǎng)后,制備單抗腹水,對所得單克隆抗體的效價、親和力、特異性等進行鑒定。制備出了1株能穩(wěn)定分泌抗MrkD蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞株E01,其中抗體亞類為IgG1,腹水效價為1:256,000,相對親和力為0.3μg/mL,特異性反應顯示,與大腸埃希菌,副傷寒沙門菌,銅綠假單胞菌,產(chǎn)單核細胞李斯特桿菌均無交叉反應性。為下一步篩選鑒定MrkD蛋白的B細胞表位提供基礎。 為篩選鑒定MrkD蛋白的B細胞表位,用純化的抗MrkD蛋白的單克隆抗體作為篩選配基,對噬菌體展示隨機12肽文庫進行三輪生物親和淘選,高親和力噬菌體得以富集;通過夾心ELISA、競爭ELISA鑒定出了33個陽性噬菌體克隆,為了找到核心序列,從中挑選16個陽性克隆進行序列測定和分析。發(fā)現(xiàn)陽性克隆大多呈遞QKTLAKSTYMSA序列,其第3、4、5、9和11位置上的T、L、A、Y、S氨基酸與MrkD氨基酸殘基(148-159位)有較高同源。說明T、L、A、Y、S可能決定了此B細胞表位的抗原性質(zhì),是該B細胞表位構成的關鍵氨基酸。使用帶有QKTLAKSTYMSA序列的C1噬菌體克隆免疫BALB/c小鼠,通過ELISA和Western-blotting分析結果證實具有刺激小鼠產(chǎn)生抗體的能力,從而證明了M148-159是MrkD蛋白的B細胞表位。 對MrkD蛋白的Th細胞表位的篩選鑒定,Th細胞表位體外實驗鑒定首先采用生物信息學軟件預測MrkD蛋白可能的H-2d限制性Th表位,并合成表位肽,采用淋巴細胞增殖試驗、流式細胞分析等實驗方法進行了篩選和鑒定,獲得BALB/c小鼠H-2d限制性Th細胞表位三條(M221-235,M175-189和M264-278),通過進行表位肽協(xié)同刺激試驗,ELISA檢測細胞因子試驗,發(fā)現(xiàn)三個表位之間具有協(xié)同刺激效應,發(fā)現(xiàn)M221-235和M175-189為Th2細胞表位,M264-278為Th1細胞表位。Th細胞表位體內(nèi)鑒定試驗首先用已初步鑒定的表位多肽(M221-235,M175-189和M264-278)免疫BALB/c小鼠,進行淋巴細胞增殖試驗來檢測多肽免疫小鼠的細胞免疫應答,通過半定量RT-PCR檢測多肽免疫小鼠脾淋巴細胞的細胞因子表達,發(fā)現(xiàn)三個表位肽能誘導機體產(chǎn)生特異性的CD+4 T淋巴細胞應答,表位肽致敏的淋巴細胞能識別相應多肽及rMrkD。 在篩選鑒定得到了1個B細胞表位和3個Th細胞表位的基礎上,進行了肺炎克雷伯菌表位疫苗的設計、構建及免疫原性研究,通過三組柔性氨基酸將此四個表位依次串聯(lián)并進行人工合成,構建重組質(zhì)粒KMepi的。重組質(zhì)粒轉入大腸桿菌BL21,挑取單菌落以IPTG誘導表達,SDS-PAGE電泳觀察蛋白表達情況,與對照組相比在31kD與45kD之間有目的蛋白的表達。純化的EPI蛋白能誘導機體產(chǎn)生特異性細胞免疫應答,表位疫苗能誘導小鼠產(chǎn)生特異性抗體。 總之,本課題證實了MrkD蛋白作為主要保護性抗原,并篩選鑒定了MrkD的1個B細胞表位和3個Th表位,并對表位的免疫學特性進行了研究,在此基礎上設計、構建了K.pn表位疫苗。構建的K.pn表位疫苗使包含的Th表位及B細胞表位各自發(fā)揮功能,為K.pn表位疫苗研究奠定了重要的實驗基礎。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1695710