本文選題：單純皰疹病毒　切入點：糖蛋白B　出處：《南京醫(yī)科大學》2010年碩士論文

【摘要】： 人類單純皰疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)感染在全世界都非常普遍,并且在生命的任何階段都可能發(fā)生。HSV I型感染主要引起生殖器以外的皮膚、粘膜(口腔粘膜)和器官(腦)的感染。HSV II型感染主要引起生殖器部位皮膚粘膜感染。HSV感染人體發(fā)病率高,復發(fā)率也高,對人體危害嚴重,可導致不孕、新生兒死亡�，F(xiàn)有的抗病毒藥物并不能有效的預防HSV原發(fā)感染、已經(jīng)建立的潛伏感染及復發(fā)性感染。因此,研制和接種安全有效的HSV疫苗是預防該病毒的理想方法。 HSV包膜糖蛋白在病毒的感染過程中起重要作用,介導病毒與宿主細胞的結合及融合,刺激機體產(chǎn)生免疫應答,在疫苗研制中具有重要地位。其中gB蛋白和gD蛋白在HSV病毒表面數(shù)量較多,在病毒的吸附、穿膜、復制等過程中起到不可缺少的關鍵作用,且具有重要的抗原表位,是宿主細胞進行體液免疫和細胞免疫的主要靶標。因此,糖蛋白gB和gD是理想的HSV候選疫苗抗原。本研究分析篩選HSV I gB、HSV I gD、HSV II gD三種糖蛋白的胞外區(qū)片段抗原表位富集區(qū),利用基因工程技術在哺乳動物細胞中分別表達三種重組糖蛋白,檢測其生物學活性,為研制重組HSV I型及II型二價疫苗奠定基礎。 通過對HSV I gB、HSV I gD、HSV II gD三種糖蛋白的抗原表位分析,篩選三種糖蛋白含強抗原表位的較集中的胞外區(qū)片段,選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子,優(yōu)化設計基因的RNA二級結構,化學合成了全新的HSV I gB(gB1)、HSV I gD(gD1)、HSV II gD(gD2)基因序列。將合成的基因片段插入真核表達載體pCEP4內(nèi),獲得的重組質(zhì)粒對CHO細胞進行瞬時轉染,Western blotting檢測培養(yǎng)基上清中表達產(chǎn)物。利用親和層析方法純化細胞培養(yǎng)上清。競爭法ELISA測純化蛋白濃度,直接ELISA法檢測其抗原性。將純化的三種重組糖蛋白,間接ELISA法測血清特異性抗體效價以檢測其免疫原性。制備的三種抗gB1、抗gD1、抗gD2抗血清用體外中和試驗檢測抗體阻斷HSV病毒感染宿主細胞的能力。與此同時,將三種重組質(zhì)粒pCEP4 gB1、pCEP4 gD1、pCEP4 gD2對CHO細胞進行穩(wěn)定轉染,對抗生素篩選得到的含重組質(zhì)粒的細胞進行單克隆培養(yǎng),Dot blotting篩選高表達三種糖蛋白的細胞株。 實驗結果顯示,重組糖蛋白gB1、gD1、gD2在哺乳動物細胞中以可溶形式表達,糖基化均一,分子量分別為85kDa、46kDa、46kDa。利用親和層析技術純化獲得了高純度的三種重組蛋白,SDS-PAGE及Weatern blotting檢測均顯示單一條蛋白帶。直接ELISA檢測顯示三種重組糖蛋白具有較好的抗原性和特異性。間接ELISA檢測免疫小鼠抗血清中三種抗體效價均≥1:5000,表明重組糖蛋白gB1、gD1、gD2有良好的免疫原性。在固定病毒 稀釋血清的中和試驗中,抗血清樣品在1:68稀釋度下對HSV I型致Vero細胞病變有抑制作用,在1:20稀釋度下對HSV II型致Vero細胞病變有抑制作用。穩(wěn)定轉染后,Dot blotting檢測篩選出兩株高表達gB1重組糖蛋白的細胞株CHO/pCEP4 gB1 1C12和CHO/pCEP4 gB1 1F7 ;兩株高表達gD1重組糖蛋白的細胞株CHO/pCEP4 gD1 C2和CHO/pCEP4 gD1 D3;兩株高表達gD2重組糖蛋白的細胞株CHO/pCEP4 gD2 E1和CHO/pCEP4 gD2 G4。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 孟祥俊;單純皰疹病毒糖蛋白的特性及其臨床意義[J];國外醫(yī)學.病毒學分冊;2002年06期

2 關蕾;楊慧蘭;樊建勇;;單純皰疹病毒Ⅱ型細胞毒性T淋巴細胞表位重組DNA疫苗的構建表達及鑒定[J];臨床皮膚科雜志;2006年06期

3 邵文愛;李曉眠;;小鼠MIP-1α真核表達質(zhì)粒的構建及在HSV-II核酸疫苗中的應用[J];細胞與分子免疫學雜志;2006年03期

4 楊慧蘭;周翠;關蕾;趙舉峰;樊建勇;;單純皰疹病毒II型CTL表位DNA疫苗的Th1/Th2免疫應答研究[J];中國皮膚性病學雜志;2007年07期

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本文編號：1695414