發(fā)布時間：2018-03-29 10:21

  本文選題：大鼠　切入點(diǎn)：肝移植　出處：《昆明醫(yī)學(xué)院》2008年博士論文

【摘要】： 受體來源未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫低反應(yīng)性的實驗研究 肝移植是治療終末期肝病的有效方法,肝臟是移植“免疫特惠”器官,移植后排斥反應(yīng)雖然沒有其他器官(如心、肺、胰和腎等)嚴(yán)重,但移植肝的排斥問題,仍然是目前有待解決的一大難題,目前雖然許多新型免疫抑制藥物的應(yīng)用使排斥反應(yīng)發(fā)生率有了明顯下降,但是免疫抑制劑的長期乃至終生應(yīng)用,除了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)之外,過度免疫抑制、病毒感染以及惡性腫瘤等也給移植患者帶來了十分不利的影響。因此,人們在致力于尋找另一種有效的方法,使移植器官能在不應(yīng)用免疫抑制劑的情況下長期、有功能的存活。其中未成熟樹突狀細(xì)胞(immaturedendritic cells,imDC)誘導(dǎo)免疫耐受或免疫低反應(yīng)被普遍認(rèn)為是一種有效的方法。 由于imDC獨(dú)特的調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的生物學(xué)特性,使其越來越為移植領(lǐng)域所重視,同種異體肝移植中,imDC通過阻斷抗原遞呈、使T細(xì)胞不能活化達(dá)到誘導(dǎo)免疫低反應(yīng)甚至免疫耐受,避免或減輕排斥反應(yīng),延長移植物存活的目的。目前正在進(jìn)行的實驗研究中幾乎均是使用供體來源的imDC通過直接識別途徑誘導(dǎo)肝移植免疫耐受及免疫低反應(yīng),但來源于供體的imDC需要在移植前數(shù)天進(jìn)行體外培養(yǎng)獲得并與受體移植術(shù)前7-10d注射,這對于臨床尸體供肝的肝移植幾乎是無法操作的,而且這些供體來源的imDC會因為宿主體內(nèi)的同種異體反應(yīng)被清除,使已經(jīng)產(chǎn)生的免疫耐受或免疫低反應(yīng)作用消失。而使用受體來源的imDC則可避免以上不利因素,因此運(yùn)用受體來源imDC阻斷間接識別途徑誘導(dǎo)肝移植免疫低反應(yīng)甚至耐受可能會成為行之有效方法。 本試驗擬從以下三方面研究受體來源imDC誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫低反應(yīng)性:1、建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型:2、受體大鼠未成熟樹突狀細(xì)胞體外擴(kuò)增、鑒定及功能特性的研究,觀察其體外對同種異體T細(xì)胞增殖的抑制作用3、在前兩方面研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究不負(fù)載供體抗原的受體來源imDC誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫低反應(yīng)性。闡明其誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫低反應(yīng)性的機(jī)理。 第一部分大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型的建立 目的: 建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植的急性排斥反應(yīng)模型并觀察其急性排斥反應(yīng)的特點(diǎn)。為進(jìn)一步的實驗研究搭建堅實的技術(shù)平臺。 方法: 1采用改良“二袖套管法”,利用封閉群SD大鼠進(jìn)行大鼠肝移植模型技能訓(xùn)練。 2對照研究SD-Wistar,Wistar-Wistar配對組合的肝移植后排斥反應(yīng),分別觀察術(shù)后第4d、7d、10d天癥狀、體征、肝功能變化、移植肝病理特征等的變化,并對肝移植急性排斥反應(yīng)模型制備作出客觀評價,每組另5只觀察生存時間。 結(jié)果: 1技能練習(xí)階段受體大鼠的存活時間大多不超過72小時。此時段主要為手術(shù)操作技能的訓(xùn)練、圍手術(shù)期管理積累經(jīng)驗。 2正式實驗中兩組術(shù)后血清ALT同期比較Wistar-Wistar組明顯低于SD-Wistar組(P＜0.01)差異有顯著性,SD-Wistar組隨著術(shù)后時間延長ALT呈進(jìn)行性的升高(P＜0.01),而Wistar-Wistar組ALT逐漸下降,組內(nèi)比較差異無顯著性。 3正式實驗中兩組術(shù)后血清TBIL第7d、10d兩組比較Wistar-Wistar組明顯低于SD-Wistar組(P＜0.01)差異有顯著性;隨著術(shù)后時間延長TBIL呈進(jìn)行性的升高(P＜0.01),而Wistar-Wistar組TBIL無明顯升高,組內(nèi)比較差異無顯著性。 4正式實驗中術(shù)后7d、10d,SD-Wistar組移植肝臟病理可見匯管區(qū)三體(肝動脈、門靜脈和膽管匯管)炎細(xì)胞浸潤大量淋巴細(xì)胞浸潤,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯,肝細(xì)胞呈灶塊狀壞死,肝實質(zhì)內(nèi)散在一些淋巴、單核、中性粒細(xì)胞浸潤。少數(shù)匯管區(qū)內(nèi)有小膽管破壞。Banff評分Ⅱ-Ⅲ級。而Wistar-Wistar組,肝臟病理可見匯管區(qū)三體(肝動脈、門靜脈和膽管匯管)少量淋巴細(xì)胞浸潤,浸潤程度未達(dá)到急性排斥的診斷標(biāo)準(zhǔn),Banff評分0級。 結(jié)論: 1大鼠原位肝移植模型制作難度較大,影響因素眾多。熟練的顯微外科技術(shù),完善的圍手術(shù)期處理及耐心細(xì)致的操作是決定手術(shù)成功的關(guān)鍵。 2 SD-Wistar組大鼠肝移植出現(xiàn)明顯、穩(wěn)定的排斥反應(yīng)的特征,可作為ROLT急性排斥模型進(jìn)行相關(guān)的研究。 第二部分大鼠未成熟樹突狀細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及功能特性的研究 目的: 采用抑制性細(xì)胞因子白介素-10(IL-10)體外抑制樹突狀細(xì)胞成熟過程,探討大鼠未成熟樹突狀細(xì)胞(Immature Dendritic cells,imDC)分離、培養(yǎng)、鑒定的方法,為進(jìn)一步使用imDC誘導(dǎo)大鼠異體肝移植免疫低反應(yīng)提供理論依據(jù)和治療手段。 方法: 1大鼠骨髓細(xì)胞的制備:無菌取大鼠脛骨和股骨骨髓,Tris-NH_4Cl溶液使紅細(xì)胞充分溶解。離心后重復(fù)洗滌3次。收集沉淀的骨髓細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10~6/ml備用。 2未成熟樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng):含10%FCS的完全RPMI1640重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×10~6ml,置于1%明膠包板的6孔板中。37℃、5%CO_2培養(yǎng)箱4h,棄上清,用37℃的RPMI1640輕輕洗去非貼壁細(xì)胞。貼壁細(xì)胞每孔加入含rrGM-CSF(20ng/ml)、rrIL-4(10ng/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃2ml,37℃、5%CO2培養(yǎng).培養(yǎng)至第5d,按加入細(xì)胞因子不同分為兩組:IL-4組,繼續(xù)在原培養(yǎng)基中培養(yǎng);IL-10組,上述培養(yǎng)基中加入IL-10(10ng/ml),培養(yǎng)至第9d,收集細(xì)胞。 3顯微鏡觀察:每天用倒置顯微鏡觀察、攝片。 4掃描電鏡觀察:與培養(yǎng)第8d將無菌玻片放入培養(yǎng)孔中過夜,第9d收集細(xì)胞描電鏡觀察, 5樹突狀細(xì)胞純度和表型分析:分別收集不同培養(yǎng)條件下樹突狀細(xì)胞,加入PE或FITC標(biāo)記的抗大鼠CD80、CD86、MHC-Ⅱ、OX62單克隆抗體,流式細(xì)胞儀進(jìn)行表型分析。 6混合淋巴細(xì)胞反應(yīng):分別收集不同培養(yǎng)條件下Wister大鼠樹突狀細(xì)胞,滅活增殖性,作為刺激細(xì)胞。取正常Wister大鼠脾臟,尼龍毛吸附法制備純化T細(xì)胞,作為反應(yīng)細(xì)胞。刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞按1:5、1:10、1:20、1:40混合培養(yǎng),采用MTT法,酶聯(lián)免疫檢測儀測定490nm OD值。 7調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4~+CD25~+T細(xì)胞)的檢測:將DC與T細(xì)胞以10:1比例混合培養(yǎng)加入FITC-CD4單克隆抗體和PE-CD25單克隆抗體,流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測 8樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-12水平檢測:在樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)不同時間分別收集IL-4組和IL-10組半量換液之離心上清,IL-12檢測采用抗體夾心ELISA法。 結(jié)果: 1不同細(xì)胞因子刺激下和不同培養(yǎng)時間樹突狀細(xì)胞的生長情況和形態(tài):大鼠樹突狀細(xì)胞呈現(xiàn)半懸浮生長狀態(tài)。培養(yǎng)至第3d,可見部分細(xì)胞附壁生長,在第5d出現(xiàn)毛刺狀細(xì)胞,隨著培養(yǎng)時間的延長,IL-4組此類細(xì)胞數(shù)量增多,毛刺狀突起更加明顯,并逐漸脫壁;至第9d,可以觀察到形態(tài)均一、毛刺狀聚集成簇的成熟樹突狀細(xì)胞;IL-10組樹突狀細(xì)胞毛刺狀和聚集體不明顯,仍停留在未成熟狀態(tài)。 2樹突狀細(xì)胞表型分析:IL-4組及IL-10組樹突狀細(xì)胞在培養(yǎng)結(jié)束時表面表達(dá)OX62(大鼠樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志)的細(xì)胞比率分別為89.46±5.94%和88.60±4.22%,兩組比較,無明顯差異(P＞0.05),說明利用IL-10不影響樹突狀細(xì)胞分化與擴(kuò)增,可以獲得較高純度的未成熟樹突狀細(xì)胞。IL-4組共刺激分子CD80和CD86表達(dá)水平分別為88.18±5.72%和81.98±6.30%,MHC-Ⅱ類分子表達(dá)水平為83.46±6.32%;IL-10組樹突狀細(xì)胞表面CD80和CD86表達(dá)水平分別為20.59±3.21%和19.89±2.48%MHC-Ⅱ類分子表達(dá)水平為19.62±2.30%;兩組比較,差異具有顯著性(P＜0.01),說明IL-10能夠抑制樹突狀細(xì)胞的成熟過程,阻斷其表面共刺激分子和MHC-Ⅱ類分子上調(diào)表達(dá),降低其抗原提呈能力。 3混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中,刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞按1:5、1:10、1:20和1:40共同培養(yǎng),IL-4組樹突狀細(xì)胞刺激同種異體T細(xì)胞的增殖反應(yīng)強(qiáng)度(OD值)分別為:0.669±0.251、1.144±0.125、1.547±0.136、1.944±0.112;IL-10組樹突狀細(xì)胞刺激同種異體T細(xì)胞的增殖反應(yīng)強(qiáng)度(OD值)分別為0.304±0.052、0.52±0.084、0.624±0.078。兩組比較,差別具有顯著性(P＜0.05),說明IL-10組樹突狀細(xì)胞對同種異體T細(xì)胞的刺激能力低下,本實驗培養(yǎng)的imDC在體外有誘導(dǎo)免疫低反應(yīng)的作用。 4未經(jīng)DC刺激的T細(xì)胞CD4~+CD25~+Tre細(xì)胞的比例很低,約為1.91±0.24%。經(jīng)imDC、mDC刺激后CD4~+CD25~+Tre細(xì)胞的比例較刺激均有所升高,但imDC刺激后升高的幅度較mDC組明顯升高(P＜0.05)。 5樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-12水平檢測IL-4組樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)7d以后,上清中IL-12水平明顯增高,而IL-10組樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-12水平增高不明顯,與同期IL-4組比較,明顯處于低狀態(tài),差異具有顯著性(P＜0.05)。 結(jié)論: 1利用IL-10在體外能夠抑制大鼠樹突狀細(xì)胞的成熟,而不影響骨髓前體細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞的分化。 2本實驗從形態(tài)學(xué)、特異性表面標(biāo)志OX62、共刺激分子、功能活性等方面進(jìn)行全面鑒定,證實了分離、培養(yǎng)體系的正確性。 3利用IL-10誘導(dǎo)imDC擴(kuò)增方法簡單、可靠、高效。 第三部分受體來源未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫低反應(yīng)性的機(jī)理研究 目的: 在建立穩(wěn)定的大鼠肝移植急性排斥模型及imDC體外擴(kuò)增、鑒定的基礎(chǔ)上,采用不負(fù)載供者抗原的受者imDC阻斷間接識別途,誘導(dǎo)受體產(chǎn)生免疫低反應(yīng),觀察其對于異基因大鼠肝移植的保護(hù)作用,探討imDC抑制排斥反應(yīng)的機(jī)理。 方法: 1以SD大鼠作為供體,Wistar大鼠作為受體的大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型建立,見第一部分。 2受體(Wistar大鼠)來源的未成熟樹突狀細(xì)胞的獲取、鑒定,見第二部分。 3實驗分組 將實驗動物隨機(jī)分為4組,每組25只,進(jìn)行不同的預(yù)處理: (1)對照組(A組):受體均為wistar大鼠未接受任何預(yù)處理。 (2)環(huán)孢素組(B組):受體均為wistar大鼠,術(shù)后第2d開始給予環(huán)孢素A處理,10mg/kg.只每天一次。 (3)成熟樹突狀細(xì)胞組(C組):術(shù)前l(fā)d經(jīng)陰莖背靜脈注射wiatar大鼠來源的成熟樹突狀細(xì)胞1×10~6/只;次日行供體為SD大鼠,受體均為wistar大鼠兩袖套原位肝移植。 (4)未成熟樹突狀細(xì)胞組(D組):術(shù)前1d經(jīng)陰莖背靜脈注射wiatar大鼠來源的未成熟樹突狀細(xì)胞1×10~6/只;次日行供體為SD大鼠,受體均為wistar大鼠兩袖套原位肝移植。 4移植大鼠生存狀態(tài)觀察和移植排斥反應(yīng)的判斷:大鼠在異基因肝移植手術(shù)后3d內(nèi)死亡,認(rèn)為死亡與手術(shù)并發(fā)癥和感染有關(guān),棄之不用。并給與補(bǔ)充,觀察每組的生存時間,根據(jù)Banff評分系統(tǒng)判斷排斥反應(yīng)程度。 5流式細(xì)胞儀檢測CD4~+CD25~+Tre細(xì)胞:分別在肝移植術(shù)后3d、5d、7d、10d,收集血標(biāo)本,送流式細(xì)胞檢測。 6血清生化指標(biāo)測定:分別在肝移植術(shù)后3d、5d、7d、10d,收集血清全自動生化分析儀測定ALT、AST、TBIL,雙抗體夾心ELISA法檢測血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平。 7移植肝臟組織學(xué)檢查:HE染色、免疫組化(FasL/Fas),觀察肝臟織形態(tài)結(jié)構(gòu)和排斥反應(yīng)。 8 Western蛋白印跡分析:檢測各組Foxp3編碼的Scurfin蛋白的表達(dá)。 結(jié)果: 1 B、D組術(shù)后生存中位時間明顯長于A、C組,差異有顯著性(P＜0.05)。 2移植術(shù)后各組大鼠血清生化檢查:在移植術(shù)后3、5、7、10肝功能B、D組。逐漸恢復(fù),A、C組ALT、AST、TBIL急劇上升,與存活時間表現(xiàn)一致。A、C組IL-2、IFN-γ明顯高于B、D組(P＜0.01),而IL-4、IL-10明顯低于B、D組(P＜0.01)。 3外周血CD4~+CD25~+Tre流式細(xì)胞檢測:D組CD4~+CD25~+Tre 7d、10d明顯高于其他3組,差異有顯著性(P＜0.05)。 4移植肝臟形態(tài)學(xué)檢測:A、C組與B、D組同期比較排斥反應(yīng)明顯嚴(yán)重(P＜0.05) 5 Western蛋白印跡分析檢測:D組10d Foxp3編碼的Scurfin蛋白的表達(dá)明顯高于其他3組,結(jié)果與CD4~+CD25~+Tre流式細(xì)胞檢測一致。 結(jié)論: 1間接識別在急性排斥作用中也起著重要的作用,通過阻斷該途徑能明顯延長移植物存活時間。 2 imDC可能通過以下機(jī)理誘導(dǎo)免疫低反應(yīng): (1)誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。 (2)誘導(dǎo)T細(xì)胞無能或低能反應(yīng)。 (3)誘導(dǎo)免疫偏移,選擇性激活Th2細(xì)胞亞群。 (4)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：1680705