本文選題：創(chuàng)傷弧菌　切入點：金屬蛋白酶　出處：《南方醫(yī)科大學》2008年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)是弧菌屬第5群細菌,根據(jù)其生化特性、流行病學模式以及宿主范圍將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個亞型,其中Ⅰ型Vv是導致人群創(chuàng)傷感染及原發(fā)性敗血癥的病原體。創(chuàng)傷弧菌感染一旦出現(xiàn)敗血癥,其死亡率高達50%以上。原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌感染發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢。我國國內(nèi)1990年首次報道一例,隨后沿海各地區(qū)每年都有散發(fā)病例報道,其病死率一直居高不下。對本病的認識不足,發(fā)病早期未能正確診斷,或誤診為藥物超敏反應而使用大劑量激素,是造成高病死率的主要原因。因此,認清創(chuàng)傷弧菌感染的特點及致病機制,建立適合的診斷方法至關(guān)重要。 有研究表明金屬蛋白酶(VVP)及溶細胞毒素(VVC)作為創(chuàng)傷弧菌的兩種胞外產(chǎn)物,與創(chuàng)傷弧菌的致病性密切相關(guān)。雖然目前有大量關(guān)于金屬蛋白酶及溶細胞毒素與創(chuàng)傷弧菌致病性關(guān)系的研究,例如:有學者認為金屬蛋白酶具有增加血管通透性,引起出血性損傷的作用;而溶細胞毒素是創(chuàng)傷弧菌分泌的一種水溶性的多肽,是創(chuàng)傷弧菌致病性的重要因素之一。但是目前這兩種胞外產(chǎn)物的具體致病機制及其在感染創(chuàng)傷弧菌機體中的定位并未明了。 在對創(chuàng)傷弧菌感染的診斷方面,由于創(chuàng)傷弧菌引起的腹瀉及最初的癥狀并無特異性,因而實驗室診斷成為最可靠的確診手段。以免疫學為基礎(chǔ)的血清學檢測,是采用單克隆或多克隆抗體,利用抗原抗體特異性反應,并結(jié)合生物化學或物理學方法而建立的免疫學檢測方法。由于其操作簡便、快速,結(jié)果易于判定,在創(chuàng)傷弧菌的鑒定中日益顯出優(yōu)勢。而以免疫學為基礎(chǔ)的血清學檢測診斷的實施,其首要條件是選擇合適的被測靶抗原,并且獲得針對靶抗原的高質(zhì)量特異性抗體也是其根本所在。金屬蛋白酶及溶細胞毒素均是創(chuàng)傷弧菌的胞外產(chǎn)物,且與創(chuàng)傷弧菌的致病性密切相關(guān)。另一方面,分別表達這兩種胞外產(chǎn)物的基因:vvp和vvhA,在不同創(chuàng)傷弧菌菌株之間也具有高度保守性。因此,金屬蛋白酶及溶細胞毒素可以作為創(chuàng)傷弧菌感染診斷的實驗室檢測靶標。 無論是研究這兩種胞外產(chǎn)物的具體致病機制還是要制備以它們?yōu)榘袠说腣v免疫檢測試劑盒,都必須以獲得相應的足量、高純度的金屬蛋白酶和溶細胞毒素為基礎(chǔ)。但是金屬蛋白酶和溶細胞毒素作為創(chuàng)傷弧菌種特征性的外毒素,它們自然分泌產(chǎn)量并不高,且因方法學的限制,采用常規(guī)生化方法獲得足量高純度的蛋白相當困難。而通過基因工程的方法,就可以在一個合適的系統(tǒng)中,使外源基因高效表達,從而生產(chǎn)有價值的蛋白質(zhì),對其應用或進行功能的研究。 目的: 通過基因工程的方法,建立使vvp及vvhA基因高效表達的原核表達系統(tǒng),從而得到高產(chǎn)量高純度的創(chuàng)傷弧菌金屬蛋白酶和溶細胞毒素。并在此基礎(chǔ)上制備分別針對二者的多克隆抗體并初步研究這兩種創(chuàng)傷弧菌胞外產(chǎn)物的具體致病作用及其在感染創(chuàng)傷弧菌機體中的定位,為揭示Vv的致病機制、臨床Vv感染的診治及進一步免疫檢測試劑的研究提供依據(jù)。 方法: 1.創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素vvhk基因及金屬蛋白酶vvp基因的體外擴增、克隆及序列分析: (1) PCR擴增、目的片斷的純化回收及連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α:以Vv基因組DNA為模板,利用PCR技術(shù)擴增vvhA、vvp基因的全長cds片斷;紫外燈下切下含目的片斷的凝膠,應用TakaRa的凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化;純化回收的目的片斷與T-載體在連接酶的作用下進行連接反應;CaCl_2法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。 (2)鑒定及序列分析:氨卞抗性篩選后,用質(zhì)粒小提試劑盒對具有氨卞抗性的克隆進行質(zhì)粒抽提;以提取的質(zhì)粒為模板進行PER擴增反應,對PCR陽性結(jié)果的重組質(zhì)粒再用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I進行雙酶切鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pGEM-T-vvhA和pGEM-T-vvp,并進行測序,對測序結(jié)果進行序列分析。 2.創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素vvhA及金屬蛋白酶vvp重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定: (1)原核表達載體的構(gòu)建:對重組質(zhì)粒pGEM-T-vvhA、pGEM-T-vvp及質(zhì)粒pET-32a~+用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I雙酶切后的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。切下含有目的片斷的凝膠帶后,進行純化回收。vvp、vvhA基因片斷分別與pET-32a~+質(zhì)粒酶切片斷在T_4連接酶的作用下連接;并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)。 (2)重組質(zhì)粒的篩選和鑒定:用質(zhì)粒小提試劑盒對具有氨卞抗性的克隆進行質(zhì)粒抽提;以提取的質(zhì)粒為模板進行PCR鑒定和以BamH I和Xho I雙酶切鑒定后,將兩種重組質(zhì)粒分別命名為pET-32a-vvhA和pET-32a-vvp。以誘導劑IPTG誘導外源基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達,對表達產(chǎn)物作SDS-PAGE分析,將融合蛋白分別命名為rVVP及rVVC,并以抗6×His組氨酸單克隆抗體為一抗對融合蛋白的表達進行免疫印跡檢測。 3.溶細胞毒素及金屬蛋白酶重組蛋白的純化及抗原性分析: (1)蛋白表達條件的優(yōu)化:對蛋白表達可溶性進行分析后針對誘導過程中對工程菌表達蛋白產(chǎn)生影響的4個因素:誘導時間、誘導溫度、誘導劑濃度以及誘導時搖菌的轉(zhuǎn)數(shù),運用統(tǒng)計學軟件進行正交實驗設(shè)計,對結(jié)果進行直觀分析及方差分析。對實驗得出的最佳誘導條件組合進行驗證。 (2)目的蛋白的純化、復性、濃縮、濃度測定及抗原性分析:以最佳誘導條件對重組工程菌進行誘導后,超聲破菌。融合蛋白rVVP及rVVC經(jīng)過His-Bind親和層析方法獲得純化。純化后的蛋白以透析法進行復性和濃縮。采用Bradford法進行蛋白定量,繪制標準曲線計算出蛋白濃度。以純化后的重組蛋白為抗原,以兔抗創(chuàng)傷弧菌全菌血清為一抗,通過間接ELISA法及Western-blot檢測重組蛋白抗原性。 4.溶細胞毒素及金屬蛋白酶多克隆抗體的制備及溶細胞毒素及金屬蛋白酶致病性的研究: (1)多克隆抗體的制備:將蛋白與佐劑1:1混合后注射新西蘭大白兔,皮下多點注射。用免疫瓊脂雙擴散法初步檢測抗體的滴度,當?shù)味冗_到1:16后,頸動脈放血,提取血清,并對免疫血清進行效價測定及特異性檢測;根據(jù)抗血清特異性檢測結(jié)果,對多抗血清進行吸收純化,得到多克隆抗體。 (2)溶細胞毒素及金屬蛋白酶致病性的研究:昆明小鼠36只,應用隨機數(shù)字表法隨機分成6組,每組6只,分別為溶細胞毒素注射組、金屬蛋白酶注射組、溶細胞毒素及金屬蛋白酶聯(lián)合注射組、Vv活菌注射組及對照1組、對照2組。Vv活菌注射組腹腔注射Vv菌液;對照1組腹腔注射等量的滅菌的Marinebroth 2216培養(yǎng)基;溶細胞毒素注射組及金屬蛋白酶注射組小鼠分別注射前述純化復性的rVVC及rVVP,聯(lián)合注射組小鼠注射rVVC和rVVP的混合液;對照2組尾靜脈注射等量的滅菌的透析液。隨后對小鼠一般情況進行觀察及臟器組織的Vv分離鑒定和病理學觀察,以確定溶細胞毒素及金屬蛋白酶對各臟器組織的致病性;以所制備的多克隆抗體為一抗免疫組化法檢測組織中創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素和金屬蛋白酶的分布情況。 結(jié)果: 1.創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素vvhA基因及金屬蛋白酶vvp基因的體外擴增、T-A克隆及序列分析: 從VvATCC27562株DNA模板中擴增vvhA基因及vvp基因cds全長,均獲得與預期大小相符合的目的條帶。經(jīng)過T-A克隆得到重組質(zhì)粒pGEM-T-vvhA和pGEM-T-vvp,對其進行測序、序列分析及比對:vvp基因cds全長1830bp,A、T含量分別為25.96%和24.54%,(G+C)含量占49.5%。其核苷酸序列與創(chuàng)傷弧菌E86株的vvp基因序列(GeneBank No.DQ923325)比較,同源性為99%,有17處點突變。其中15處為同義突變;2處為錯義突變:vvhA基因cds全長1356bp,A、T含量分別為27.65%和23.89%,(G+C)含量占48.45%。其核苷酸序列與創(chuàng)傷弧菌CDC B3547株的vvhA基因序列(GeneBank No.AB124803.1)比較,同源性為99%,有9處點突變并且均為同義突變。 2.創(chuàng)傷弧菌溶細胞毒素vvhA及金屬蛋白酶vvp重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定: 表達載體pET-32a-vvhA及pET-32a-vvp轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后,經(jīng)IPTG誘導,均能表達融合蛋白。Western-blot免疫印跡實驗結(jié)果表明表達產(chǎn)物rVVC及rVVP均能與抗6×His組氨酸單克隆抗體特異性結(jié)合,這一結(jié)果也證實所構(gòu)建的兩種原核表達系統(tǒng)均能表達融合6×His組氨酸的蛋白。 3.溶細胞毒素金屬蛋白酶重組蛋白的純化及抗原性分析: 基于正交實驗設(shè)計優(yōu)化融合蛋白的表達條件,對實驗結(jié)果的直觀分析及方差分析均表明:各因素對rVVP表達的重要性依次為誘導搖菌轉(zhuǎn)數(shù)、誘導時間、誘導溫度、誘導劑IPTG濃度。本實驗的最佳組合誘導條件為搖菌轉(zhuǎn)數(shù)250r/m、誘導時間4h、誘導溫度37℃、誘導劑IPTG濃度1mmol/L:而各因素對rVVC表達的重要性依次為誘導時間、搖菌轉(zhuǎn)數(shù)、誘導劑IPTG濃度、誘導溫度。本實驗的最佳搭配誘導條件為搖菌轉(zhuǎn)數(shù)250r/m、誘導時間4h、誘導溫度30℃、誘導劑IPTG濃度1mmol/L。在各自優(yōu)化的誘導條件下兩種蛋白均能高效表達,蛋白表達量分別達到了40.67%(rVVP)及58.27%(rVVC)。通過親和層析的方法可以獲得較純的蛋白,并且兩種蛋白都具有良好的抗原性。 4.溶細胞毒素VVC及金屬蛋白酶VVP多克隆抗體的制備及其致病性研究: (1)多克隆抗體的效價及特異性檢測:吸收純化后的溶細胞毒素及金屬蛋白酶多克隆抗體分別與相應的溶細胞毒素及金屬蛋白酶均能很好地特異性結(jié)合,且與多種常見細菌菌體無交叉反應;兩種抗體的效價均達到了1:12800。 (2)腹腔注射Vv致小鼠感染后致小鼠多臟器損傷,尤以肺、肝臟、腎臟的損傷最為嚴重。肺和腎臟的損傷均以出血性病變?yōu)橹?而肝臟的損傷表現(xiàn)為肝細胞廣泛的水腫、氣球樣變性。 (3)溶細胞毒素及金屬蛋白酶對小鼠各臟器組織的致病性觀察:溶細胞毒素可導致小鼠肺臟的損傷,且與腹腔注射Vv致小鼠感染后肺損傷相似,以出血性病變?yōu)橹鳌６饘俚鞍酌肝磳π∈蟮母髋K器組織造成明顯損傷。溶細胞毒素聯(lián)合金屬蛋白酶作用導致的小鼠肺損傷與溶細胞毒素單獨作用沒有差別。 (4)免疫組化檢測結(jié)果:溶細胞毒素注射組、聯(lián)合注射組及Vv活菌注射組小鼠肺組織中均檢測到了溶細胞毒素的分布:主要分布于肺支氣管上皮、肺泡上皮;以兔免疫前血清作為一抗的陰性對照組肺組織,肺支氣管上皮及肺泡上皮均為陰性結(jié)果;肝臟和腎組織中未見溶細胞毒素分布。而金屬蛋白酶注射組、聯(lián)合注射及Vv活菌注射組小鼠的各主要臟器組織中均未檢測到金屬蛋白酶的分布。 結(jié)論: 1.證實了vvp基因及vvhA基因均在創(chuàng)傷弧菌的不同菌株之間具有高度的保守性。 2.構(gòu)建了創(chuàng)傷弧菌vvp基因及vvhA基因高效原核表達系統(tǒng),得到了高純度有活性的重組蛋白rVVP和rVVC;兩種蛋白均具有良好的免疫原性,為創(chuàng)傷弧菌致病機制的研究及創(chuàng)傷弧菌免疫檢測試劑盒及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。 3.成功制備了特異性較好的抗Vv溶細胞毒素多克隆抗體及抗Vv金屬蛋白酶多克隆抗體。 4.首次證實創(chuàng)傷弧菌感染機體時,溶細胞毒素對其毒性的產(chǎn)生是必須的,溶細胞毒素可獨立發(fā)揮作用對機體造成損傷;發(fā)現(xiàn)肺臟是創(chuàng)傷弧菌感染機體時其毒力因素溶細胞毒素作用的靶器官。 5、在注射劑量為0.338mg/只的情況下,金屬蛋白酶不能獨立作用對小鼠機體組織造成損傷;金屬蛋白酶對傷弧菌毒力的產(chǎn)生可能并不是必須的。 6、溶細胞毒素和金屬蛋白酶之間不存在相互協(xié)同或抑制作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392;R378

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本文編號：1647586