本文選題：骨髓間充質(zhì)干細胞　切入點：腎小管上皮樣細胞　出處：《福建醫(yī)科大學》2009年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 目的:探討體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchyml stem cells, MSCs)向腎小管上皮樣細胞分化的可能性。并觀察不同條件下骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化后的差異。 方法:抽取SD大鼠的骨髓,經(jīng)密度梯度離心分離,聯(lián)合貼壁篩選法獲取純化的骨髓間充質(zhì)干細胞,以流式細胞儀鑒定間充質(zhì)干細胞表面標志。取擴增3代的骨髓間充質(zhì)干細胞,分別用含有胎牛血清(空白對照組);胎牛血清+缺血再灌注腎臟勻漿上清+全反式維甲酸ATRA(ATRA對照組);胎牛血清+缺血再灌注腎臟勻漿上清+表皮生長因子(EGF)(EGF組);胎牛血清+缺血再灌注腎臟勻漿上清+肝細胞生長因子(HGF)(HGF組);胎牛血清+缺血再灌注腎臟勻漿上清+骨形成蛋白(BMP-7)(BMP-7組);胎牛血清+缺血再灌注腎臟勻漿上清+促紅細胞生成素(EPO)(EPO組);胎牛血清+缺血再灌注腎臟勻漿上清+上述四種因子(聯(lián)合誘導組)的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。誘導7天后,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化;化學染色檢測細胞堿性磷酸酶表達,免疫細胞化學法檢測cytokeratin-18蛋白的表達,免疫熒光細胞化學法檢測E-cadherin蛋白的表達,RT-PCR檢測E-cadherinmRNA的表達。 結(jié)果: (1)流式細胞儀顯示體外分離培養(yǎng)的第3代大鼠骨髓干細胞表面抗原表達: CD44陽性細胞表達率98.7%,CD90陽性細胞表達率98.1%, CD29陽性細胞表達率96.1%,而CD11b/c陽性細胞表達率14.7%, CD34陽性細胞表達率1.98%;(2)誘導7天后,與空白對照組相比,ATRA對照組和單因子誘導組(EGF組、HGF組、BMP-7組、EPO組)部分細胞變圓形、短梭形單層排列,聯(lián)合誘導組的大部分細胞變圓形、短梭形,細胞密集處呈鵝卵石樣排列;(3)堿性磷酸酶染色示:空白對照組細胞為陰性,ATRA對照組和單因子誘導組(EGF組、HGF組、BMP-7組、EPO組)有出現(xiàn)部分的陽性細胞,而在聯(lián)合誘導組中陽性細胞數(shù)明顯的增多;(4)免疫細胞化學示:空白對照組無表達,cytokeratin-18各組表達的陽性細胞率分別為:ATRA對照組27.40±2.70%;單因子EGF組29.60±4.51%;單因子HGF組26.20±3.70%;單因子BMP-7組26.80±5.00%;單因子EPO組27.80±3.03%;聯(lián)合誘導組44.00±3.16%,與空白對照組相比均明顯增加(P0.01 vs空白對照組),其中聯(lián)合誘導組增加更為明顯;(5)免疫熒光細胞化學示:在高倍視野下,空白對照組無表達, E-cadherin各組表達的陽性細胞均數(shù)分別為:ATRA對照組16.40±2.69;單因子EGF組18.25±3.50;單因子HGF組19.24±3.41;單因子BMP-7組16.06±2.00;單因子EPO組19.33±3.57;聯(lián)合誘導組30.26±5.16,與空白對照組相比均明顯增加(P0.01 vs空白對照組),其中聯(lián)合誘導組增加更為明顯;(6)RT-PCR方法檢測到聯(lián)合誘導組MSC的E-cadherin的mRNA表達明顯高于ATRA對照組和單因子誘導組(P㩳0.01),而空白對照組不表達。 結(jié)論:以上四中因子在體外模擬的急性腎衰微環(huán)境中可誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化為腎小管上皮樣細胞。
[Abstract]:Aim: to investigate the possibility of inducing mesenchymal stem cells (MSCs) to differentiate into renal tubular epithelioid cells (TECs) in vitro. Methods: bone marrow of SD rats was isolated by density gradient centrifugation and purified bone marrow mesenchymal stem cells were obtained by adherent screening. The surface markers of mesenchymal stem cells (MSCs) were identified by flow cytometry. Fetal bovine serum (blank control group); fetal bovine serum ischemia reperfusion renal homogenate supernatant total trans retinoic acid (ATRA(ATRA) control group; fetal bovine serum ischemia reperfusion kidney homogenate supernatant epidermal growth factor (EGF) group; Fetal bovine serum homogenate supernatant hepatocyte growth factor HGFGF-HGF group; fetal bovine serum homogenate supernatant bone morphogenetic protein (BMP-7); fetal bovine serum homogenate homogenate homogenate supernatant promotion; fetal bovine serum ischemia reperfusion renal homogenate homogenate supernatant supernatant of HGF group; fetal bovine serum ischemia reperfusion renal homogenate supernatant supernatant. Erythropoietin EPO-EPO group and fetal bovine serum ischemia reperfusion kidney homogenate supernatant of the above four factors (combined induction group) were cultured. After 7 days of induction, The expression of alkaline phosphatase was detected by chemical staining, the expression of cytokeratin-18 protein was detected by immunocytochemistry, the expression of E-cadherin protein was detected by immunofluorescence cytochemistry and the expression of E-cadherinmRNA was detected by RT-PCR. Results:. Flow cytometry showed that the expression rate of CD44 positive cells was 98.70.The expression rate of CD90 positive cells was 98.1. The expression rate of CD29 positive cells was 96.1.The expression rate of CD11b/c positive cells was 14.7g and CD34 positive cells was 14.7%. The expression rate of sex cells was 1.98%, 7 days after induction, Compared with the blank control group, the cells of ATRA control group and EGF group HGF group (HGF group) became round, short fusiform monolayer arrangement, and most of the cells in the combined induction group became round and fusiform. The results of alkaline phosphatase staining showed that the cells in the blank control group were negative ATRA control group and single factor induction group (EGF group, HGF group, BMP-7 group, EPO group). Immunocytochemistry showed that the positive rate of cytokeratin-18 in the blank control group was 27.40 鹵2.70 in the control group, 29.60 鹵4.51 in the single-factor EGF group, 26.20 鹵3.70 in the single-factor HGF group and 27.40 鹵2.70 in the single-factor BMP-7 group. Group 26.80 鹵5.00; single factor EPO group 27.80 鹵3.03; combined induction group 44.00 鹵3.16; compared with blank control group, P 0.01 vs blank control group; The average number of positive cells in E-cadherin group was 16.40 鹵2.69 in control group, 18.25 鹵3.50 in single-factor EGF group, 19.24 鹵3.41 in single-factor HGF group, 16.06 鹵2.00 in single-factor BMP-7 group, 19.33 鹵3.57 in single-factor EPO group and 30.26 鹵5.16 in combined induction group, respectively. The mRNA expression of MSC in the co-induction group was significantly higher than that in the ATRA control group and the univariate induction group by RT-PCR, and the expression of E-cadherin in the co-induction group was significantly higher than that in the ATRA control group and single-factor induction group, and the expression of E-cadherin in the co-induction group was significantly higher than that in the co-induction group. It was not expressed in the blank control group. Conclusion: the above four factors can induce the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into renal tubular epithelioid cells in acute renal decay environment in vitro.
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

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本文編號：1646159