本文選題：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞　切入點(diǎn)：γδT細(xì)胞　出處：《中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 第一部分小鼠調(diào)節(jié)性γ6T細(xì)胞的初步研究 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells, Tregs)是T細(xì)胞的一個(gè)亞群,能通過影響其它免疫細(xì)胞的活性來(lái)發(fā)揮抑制免疫應(yīng)答的功能。近年來(lái),調(diào)節(jié)性T細(xì)胞成為免疫學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)：經(jīng)典的CD4+CD25+TCRαβTreg的功能已經(jīng)基本明了,CD4+CD25- T細(xì)胞在體外經(jīng)過anti-TCR/CD3e的刺激和TGF-β的誘導(dǎo)可以轉(zhuǎn)變?yōu)镃D4+CD25+Treg,并且高表達(dá)Treg的特異性標(biāo)記物Foxp3。γδT細(xì)胞雖然只占總T細(xì)胞的一小部分,但其獨(dú)特的抗原識(shí)別模式使得γδT細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái),許多研究結(jié)果表明γδT細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)功能。我們感興趣的是小鼠的γδT細(xì)胞是否也具有免疫調(diào)節(jié)表型的亞群,以及是否可以在體外經(jīng)過anti-TCR的刺激和TGF-p的誘導(dǎo)而產(chǎn)生具有免疫調(diào)節(jié)功能的γδT細(xì)胞。我們以小鼠脾臟的T細(xì)胞為研究體系,利用流式染色和RT-PCR方法檢測(cè)γδT細(xì)胞Foxp3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,新鮮分離的小鼠脾臟γδT細(xì)胞并不表達(dá)Foxp3。然而,當(dāng)脾臟T細(xì)胞在固相化anti-TCRγδ抗體刺激下培養(yǎng),并添加TGF-β(濃度為5ng/ml)誘導(dǎo)5-8天后,Realtime PCR和免疫熒光染色結(jié)果顯示,TGF-p誘導(dǎo)組的γδT細(xì)胞出現(xiàn)Foxp3的表達(dá),與CD25表達(dá)相一致,而未誘導(dǎo)組的γδT細(xì)胞基本無(wú)Foxp3的表達(dá)。此外,相對(duì)于誘導(dǎo)組的TCRγδ+CD25-T細(xì)胞,誘導(dǎo)組的TCRγδ+CD25+T細(xì)胞不僅表達(dá)Foxp3,還高表達(dá)免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子TGF-p和GITR。隨后,我們通過體外功能實(shí)驗(yàn)證明誘導(dǎo)組的γδT細(xì)胞能夠明顯抑制anti-CD3抗體對(duì)初始T細(xì)胞的活化和增殖作用。綜上所述,小鼠γδT細(xì)胞在經(jīng)過固相化anti-TCRγδ刺激和TGF-p誘導(dǎo)后可以產(chǎn)生具有免疫調(diào)節(jié)表型和功能的細(xì)胞。 第二部分腫瘤過繼免疫治療中γδT細(xì)胞趨化機(jī)理的初步研究 γδT細(xì)胞是一類不同于αβT細(xì)胞的特殊細(xì)胞。近年的研究表明,無(wú)論是體內(nèi)還是體外,活化的γδT細(xì)胞都具有很強(qiáng)的殺傷各種實(shí)體腫瘤和血液腫瘤的活性。因此γδT細(xì)胞被認(rèn)為是用于腫瘤過繼免疫治療很有前景的細(xì)胞。然而γδT細(xì)胞在體內(nèi)是否能夠有效分布于腫瘤組織是其發(fā)揮抗腫瘤作用的前提。本實(shí)驗(yàn)室建立了一套固相化anti-TCRγδ抗體體外擴(kuò)增培養(yǎng)γδT細(xì)胞的方法,所獲γδT細(xì)胞制劑在體外具有很強(qiáng)的殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。為了考察γδT細(xì)胞制劑在體內(nèi),特別是腫瘤組織的分布規(guī)律,我們首先分析了培養(yǎng)后γδT細(xì)胞表面趨化因子受體的表達(dá)情況,隨后以結(jié)直腸癌為研究對(duì)象,分析了結(jié)直腸癌細(xì)胞系和結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中趨化因子的表達(dá)情況,最后利用趨化實(shí)驗(yàn)和趨化封閉實(shí)驗(yàn)考察了結(jié)直腸癌組織對(duì)γδT細(xì)胞的趨化作用。 γδT細(xì)胞制劑制備于固相化抗體體外擴(kuò)增的人外周血單個(gè)核細(xì)胞,γδT細(xì)胞在擴(kuò)增前后趨化因子受體的表達(dá)情況采用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示CCR5和CXCR3是體外擴(kuò)增的Vδ1T細(xì)胞和Vδ2T細(xì)胞表面主要的趨化因子受體。用RT-PCR法檢測(cè)4種人結(jié)直腸癌細(xì)胞系和10例人結(jié)直腸癌組織標(biāo)本(每例均包括腫瘤組織和瘤旁組織)趨化因子的表達(dá)情況。結(jié)果表明,不同的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系能夠表達(dá)不同的趨化因子；人結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中腫瘤組織和瘤旁組織也存在多種趨化因子的表達(dá),其中均包括CCR5和CXCR3的配體分子。因此,我們以兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT-29和HR8348)為代表,進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞對(duì)γδT細(xì)胞的趨化實(shí)驗(yàn),并利用CCR5和CXCR3封閉抗體考察了兩種趨化因子受體在γδT細(xì)胞趨化作用中的貢獻(xiàn)。結(jié)果顯示經(jīng)過體外擴(kuò)增后的γδT細(xì)胞具有向腫瘤細(xì)胞遷移的能力,且趨化作用可以部分被CCR5和CXCR3抗體封閉。我們的研究結(jié)果表明,體外擴(kuò)增的γδT細(xì)胞具有分布于結(jié)直腸癌組織的能力,該能力為其進(jìn)一步在腫瘤局部發(fā)揮殺傷作用奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Preliminary study on regulatory gamma 6T cells in the first part of mice
Regulatory T cells (Regulatory T cells, Tregs) is a subgroup of T cells, can play the function of suppressing the immune response by affecting the activity of other immune cells. In recent years, regulatory T cells become a hot research topic in the field of immunology: classic CD4+CD25+TCR alpha beta Treg function has been basically clear. CD4+CD25- T cells in vitro induced by anti-TCR/CD3e stimulation and TGF- beta can be changed into CD4+CD25+Treg, and high expression of cell specific markers Foxp3. gamma delta T Treg account for only a small part of the total T cells, but its unique antigen recognition pattern makes gammadelta T cells play an important role in the immune system in recent years, many research results show that gamma delta T cells have immune regulatory function. We are interested in murine gammadelta T cells also have immunomodulatory phenotype subsets, and whether you can in vitro by By anti-TCR stimulation and TGF-p and have the immunoregulatory function of gamma delta T cells. We use mouse spleen T cells as the research system, expressed by flow cytometry staining and RT-PCR Foxp3 method for the detection of gamma delta T cells. The results showed that freshly isolated spleen cells did not express T gamma delta Foxp3. however, when the T cells in the spleen of anti-TCR gammadelta antibody stimulation in solid culture, and add the TGF- beta (concentration of 5ng/ml) after 5-8 days of induction, Realtime PCR and immunofluorescence staining showed that TGF-p induced group of gamma delta T cells Foxp3 expression, consistent with the expression of CD25, expression and non induced group gamma delta T cells is essentially free of Foxp3. In addition, compared with the TCR gamma delta +CD25-T cell group, induction group TCR gamma delta +CD25+T cells not only express Foxp3, but also the high expression of immune related molecules TGF-p and GITR. then we can pass the test body The induction of gamma delta T cells in the induction group can significantly inhibit the activation and proliferation of anti-CD3 antibody on the initial T cells. In conclusion, the gamma delta T cells can produce immunoregulatory phenotype and function cells after solid anti-TCR anti-TCR delta stimulation and TGF-p induction.
Preliminary study on the chemotactic mechanism of gamma delta T cells in the second part of the tumor adoptive immunotherapy
Gamma delta T cells were different from alpha beta T cells specific cells. Recent studies have shown that either in vivo or in vitro, activation of gamma delta T cells have strong killing a variety of solid tumors and hematological tumor activity. Therefore gamma delta T cells were considered for tumor adoptive immunotherapy is promising cells. However, gamma delta T cells in vivo is effectively distributed in tumor tissue is the prerequisite for the antitumor effect. The laboratory has established a set of immobilized anti-TCR antibody in vitro culture method of gamma delta gamma delta T cells, the gamma delta T cell preparation has strong killing tumor cells the activity in vitro. In order to investigate the preparation of gamma Delta T cells in vivo, especially the distribution of tumor tissue, we first analyzed the expression of chemokine receptors on the surface of T cells after incubation, followed by colorectal cancer as the research object, analysis The expression of chemokines in colorectal cancer cell lines and colorectal cancer tissues was detected. Finally, chemotaxis and chemotactic blocking experiments were used to investigate the chemotactic effect of colorectal cancer tissues on T cells.
Gamma delta T cells in preparation of immobilized antibody in vitro amplification of human peripheral blood mononuclear cells, T cells in the amplification and expression of chemokine receptors was analyzed by immunofluorescence staining and flow cytometry. The results showed that CCR5 and CXCR3 are amplified in vitro V Delta 1T cells and surface V the main Delta 2T cell chemokine receptor. The detection of 4 human colorectal cancer cell lines and 10 cases of human colorectal carcinoma tissues by RT-PCR method (each case including tumor tissues and adjacent tissues) expression of chemokines. The results showed that different human colorectal cancer cell lines expressed different chemotaxis factor; human colorectal cancer tissues in tumor tissues and adjacent tissues of various chemokine ligand molecules, which are including CCR5 and CXCR3. Therefore, we use two kinds of colon cancer cell lines (HT-29 and HR8348) as the representative of swelling The trend of tumor cells of gamma delta T cells, and the use of CCR5 and CXCR3 blocking antibodies examined two chemokine receptors in chemotaxis contribution in gamma delta T cells. The results showed that after in vitro expansion of gamma delta T cells have the ability to migrate to tumor cells, and chemotaxis can be part of CCR5 and CXCR3 antibodies closed. Our results showed that in vitro amplification of gamma delta T cells have the ability of distribution in colorectal cancer tissues, the ability for further play in local tumor killing effect of the foundation.

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1639546