發(fā)布時間：2018-03-19 09:16

  本文選題：日本腦炎病毒　切入點(diǎn)：E蛋白　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：日本腦炎病毒（JEV）是黃病毒科、黃病毒屬主要成員，病毒通過蚊子叮咬傳播，可引起人類急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染性疾病日本腦炎（我國也稱流行性乙型腦炎，簡稱乙腦），主要發(fā)病人群為兒童，重癥病死率較高，近三分之一的幸存者留有各種各樣的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，仍然嚴(yán)重威脅公眾健康。隨著全球氣候暖化，日本腦炎病毒的流行地域也不斷擴(kuò)大，成為全球性的公共衛(wèi)生問題。 JEV E蛋白是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，參與病毒吸附、穿入，與其致病性密切相關(guān)。本課題組制備了兩株具有高中和活性的抗JEV單克隆抗體（2H4和2F2），并在多種感染動物模型上證實(shí)了其顯著的被動保護(hù)作用，但抗體與JEV相互作用的機(jī)制尚未完全闡明。因此，本研究利用分子生物學(xué)方法獲得2H4和2F2抗體可變區(qū)基因，原核表達(dá)并純化了2H4和2F2重鏈可變區(qū)，確認(rèn)了原核表達(dá)的重鏈可變區(qū)產(chǎn)物與JEV的結(jié)合活性，利用計算機(jī)軟件構(gòu)建了2H4和2F2可變區(qū)的空間模型，再與已有的JEV E蛋白空間模型進(jìn)行了模擬分子對接，了解了對抗體結(jié)合活性有重要影響的關(guān)鍵氨基酸，為最終闡明抗體中和作用機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.確定了2H4、2F2可變區(qū)基因 培養(yǎng)2H4、2F2雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)RNA提取試劑RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)GenBank中鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因序列，設(shè)計出分別針對FR1和FR4的上、下游引物，以總RNA為模板擴(kuò)增2H4、2F2可變區(qū)基因。進(jìn)行了2H4、2F2重鏈和輕鏈可變區(qū)基因核苷酸序列同源性分析（BLASTN，此過程在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行），并用IMGT/V-QUEST分析了可變區(qū)結(jié)構(gòu)，確定了2H4、2F2單抗可變區(qū)CDR和FR。結(jié)果顯示，這些序列包含典型的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域以及FR1～FR4區(qū)域，完全符合鼠源性IgG抗體可變區(qū)基因的特征。2H4、2F2輕鏈可變區(qū)基因均長321bp，編碼107個氨基酸，第92位含一個半胱氨酸，并且序列完全相同。2個重鏈可變區(qū)基因序列長354bp，，編碼118個氨基酸，第22位和第96位含有維持抗體結(jié)構(gòu)的半胱氨酸。 2.原核表達(dá)了2H4、2F2重鏈可變區(qū)并確認(rèn)了與JEV的結(jié)合活性 為了便于純化，選用pRSET A載體。2H4、2F2重鏈可變區(qū)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析純化、透析，間接ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)2H4、2F2重鏈可變區(qū)表達(dá)產(chǎn)物可與JEV結(jié)合。 3.2H4、2F2單抗可變區(qū)的同源建模 根據(jù)2H4、2F2可變區(qū)基因，利用BLASTP軟件（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTP）在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中搜索相關(guān)蛋白，獲得了單抗可變區(qū)的同源蛋白，完成了氨基酸序列同源性分析。利用軟件MODELLER9v1，以同源蛋白為模板對單抗可變區(qū)的主鏈、側(cè)鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模，組裝出完整的2H4、2F2單抗可變區(qū)三維結(jié)構(gòu)模型，再對初始結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行了一系列分子動力學(xué)優(yōu)化，最終獲得了單抗可變區(qū)三維結(jié)構(gòu)的能量最低構(gòu)象。 4.2H4、2F2單抗可變區(qū)與JEV E蛋白的模擬分子對接 利用Discovery Studio v2.1軟件模擬了單抗可變區(qū)與E蛋白的分子對接，結(jié)果顯示：E蛋白上與2H4單抗可變區(qū)作用的氨基酸位點(diǎn)有5個，分別是16位絲氨酸、37位天冬氨酸、353位精氨酸、375位谷氨酸和378位苯丙氨酸殘基；2F2單抗可變區(qū)作用則有9個，分別是13位谷氨酸、16位絲氨酸、37位天冬氨酸、300位蘇氨酸、336位賴氨酸、347位天冬氨酸、354位亮氨酸、387位精氨酸和388位甘氨酸殘基。在所有位點(diǎn)中，13位谷氨酸、16位絲氨酸、37位天冬氨酸和300位蘇氨酸在E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅰ區(qū)內(nèi)，其余均在已報道過的E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ區(qū)內(nèi)。2H4、2F2單抗同時識別的16位絲氨酸和37位天冬氨酸可能是結(jié)構(gòu)域Ⅰ區(qū)中和表位的關(guān)鍵氨基酸所在。2F2的13位谷氨酸和300位蘇氨酸也未曾報道。2H4的353位精氨酸未見報道，但375位谷氨酸和378位苯丙氨酸與2F2的387位精氨酸和388位甘氨酸均位于優(yōu)勢中和抗原表位集中的結(jié)構(gòu)域Ⅲ區(qū)內(nèi)。2F2的336位賴氨酸與報道過的337位中和表位非常接近，354亮氨酸未見報道。2F2的作用位點(diǎn)多于2H4，也符合2F2中和活性高于2H4的特性。病毒血凝活性可能與2H4識別的353位精氨酸有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1633623