本文選題：骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2　切入點：脂肪源性干細胞　出處：《遵義醫(yī)學院》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 目的：構(gòu)建人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因的真核表達載體-重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hBMP-2,利用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000介導pcDNA3.1-hBMP-2轉(zhuǎn)染兔脂肪干細胞,從而探討在自身表達的hBMP.2誘導下兔脂肪干細胞成骨分化的效果,為進一步構(gòu)建組織工程骨做準備。 方法：1、設(shè)計和合成引物,并通過PCR擴增hBMP.2基因。2、使用BamHI/EcoRI分別對hBMP-2基因和質(zhì)粒pcDNA3.1進行酶切,將酶切產(chǎn)物相互連接；經(jīng)轉(zhuǎn)化、擴增后,抽提質(zhì)粒進行酶切和DNA測序鑒定。3、取三月齡新西蘭大白兔頸背部脂肪組織進行脂肪干細胞的獲得并培養(yǎng)、擴增。4、利用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000分別介導hBMP-2基因和EGFP基因轉(zhuǎn)染第4代脂肪干細胞,并使用濃度為400μg/ml G418對轉(zhuǎn)染后細胞進行篩選。5、通過熒光顯微鏡下計數(shù)轉(zhuǎn)染48h后可發(fā)綠色熒光細胞的個數(shù)明確瞬時轉(zhuǎn)染效率。6、通過MTT比色法繪制hBMP-2組(實驗組)、EGFP組(陰性對照組)及未轉(zhuǎn)染組(空白對照組)細胞的生長曲線。7、用ELISA法定量檢測各組第3天、第7天、第14天、第21天的連續(xù)三天細胞上清液中的hBMP-2含量。8、成骨分化指標的檢測：對轉(zhuǎn)染后連續(xù)培養(yǎng)7天的細胞進行Ⅰ型膠原免疫細胞化學染色；使用ALP活性檢測試劑盒分別檢測各組第3天、第7天、第14天細胞上清液中的ALP活性；使用2%茜素紅對轉(zhuǎn)染后連續(xù)培養(yǎng)14天的細胞進行鈣結(jié)節(jié)染色。結(jié)果：1、經(jīng)PCR擴增獲得了hBMP-2基因；通過轉(zhuǎn)化擴增抽提出的重組質(zhì)粒行BamHI/EcoRI酶切后獲得約1200 bp和5400bp兩個片段；其DNA測序結(jié)果與Genbank中報道的hBMP-2基因序列一致。2、脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000可以介導pcDNA3.1-hBMP-2和pcDNA3.1-EGFP成功轉(zhuǎn)染脂肪干細胞,通過計算得出其瞬時轉(zhuǎn)染率為(18.0±0.42)%,并經(jīng)過濃度為400μg/mlG418篩選后獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。MTT比色法繪制各組細胞的生長曲線觀察表明：脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000介導的目的基因轉(zhuǎn)染對脂肪干細胞的生長、增殖無明顯影響。3、連續(xù)三天細胞培養(yǎng)上清液hBMP-2 ELISA檢測表明hBMP-2組在第3天、第7天、第14天、第21天時的hBMP-2表達量均高于相應(yīng)時段的EGFP組及未轉(zhuǎn)染組(組間p0.05),且能夠穩(wěn)定表達(組內(nèi)p0.05)。根據(jù)hBMP-2標準蛋白曲線換算,在上述培養(yǎng)時段內(nèi),hBMP-2組細胞上清液中的hBMP-2含量約12.36ng hBMP-2(細胞接種濃度8×104個/孔)。4、成骨分化指標：Ⅰ型膠原免疫細胞化學染色顯示hBMP-2組細胞內(nèi)表達出Ⅰ型膠原,均高于EGFP組及未轉(zhuǎn)染組(p0.05)經(jīng)堿性磷酸酶活性檢測試劑盒檢測各組細胞不同時段上清液中的ALP活性發(fā)現(xiàn)hBMP-2組均較EGFP組及未轉(zhuǎn)染組高(組間p0.05)且隨培養(yǎng)時間延長hBMP-2組ALP的活性逐漸增強(組內(nèi)p0.05) 2%茜素紅對轉(zhuǎn)染后連續(xù)培養(yǎng)14天的細胞進行鈣結(jié)節(jié)染色發(fā)現(xiàn)僅hBMP-2組有較多橘紅色結(jié)節(jié),而EGFP組及未轉(zhuǎn)染組無明顯發(fā)現(xiàn)。結(jié)論：成功構(gòu)建了hBMP-2基因的真核表達載體-重組pcDNA3.1-hBMP-2質(zhì)粒；利用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000可以介導hBMP-2基因成功轉(zhuǎn)染ADSCs,并對ADSCs的生長、增殖無明顯影響,并可通過G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。經(jīng)轉(zhuǎn)染hBMP-2基因的ADSCs能夠穩(wěn)定高效地表達hBMP-2,并能在自身表達的hBMP-2誘導下向成骨細胞進行分化。
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【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻】

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