本文選題：臍帶血　切入點：內(nèi)皮祖細胞　出處：《中南大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 第一章活化TLR4對人臍血內(nèi)皮祖細胞的影響及機制研究 第一節(jié)人臍血兩種類型內(nèi)皮祖細胞體外分化研究 目的:研究人臍帶血中兩種類型內(nèi)皮祖細胞的體外分化特征。 方法:采用6%羥乙基淀粉沉降法和密度梯度離心法聯(lián)合分離臍帶血中單個核細胞,在含有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過形態(tài)學(xué)、免疫熒光、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和流式細胞法分析細胞的生長特點和生物學(xué)特征。 結(jié)果:貼壁細胞分為早期內(nèi)皮祖細胞和晚期內(nèi)皮祖細胞兩種類型細胞。早期內(nèi)皮祖細胞的形態(tài)從小的圓形細胞變成以集落為中心,周圍呈發(fā)芽式向外生長的細胞群,晚期內(nèi)皮祖細胞形成典型的“鋪路石樣”。DiL標(biāo)記的乙�；兔芏戎鞍�(DiL-acLDL)和FITC標(biāo)記荊豆凝集素I(FITC-UEA-I)雙染色陽性細胞初步鑒定為內(nèi)皮祖細胞。RT-PCR提示隨著培養(yǎng)時間延長,內(nèi)皮特異性基因表達變化逐漸增強,流式細胞分析提示早期EPC有AC133、CD34、KDR表達;晚期EPCsAC133不表達,CD34表達弱,KDR表達增強。四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法提示早期EPCs增值能力弱,而晚期EPCs增值能力強: 結(jié)論:在人臍血中可培養(yǎng)出兩種類型的EPCs,兩種細胞在細胞表型、內(nèi)皮特異性基因表達及細胞增殖能力方面存在明顯的差異。為進一步研究EPCs提供實驗基礎(chǔ)。 第二節(jié)活化TLR4誘導(dǎo)早期內(nèi)皮祖細胞增殖的機制研究 目的:研究Toll樣受體(TLRs)在臍帶血內(nèi)皮祖細胞中的表達分析及脂多糖(LPS)對內(nèi)皮祖細胞的影響;分析活化的TLR4對內(nèi)皮祖細胞生長的作用及機制分析。 方法:取體外培養(yǎng)的早期內(nèi)皮祖細胞,在貼壁細胞中加入不同濃度(1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1000ng/ml)的LPS,采用RT-PCR及流式細胞分析法檢測內(nèi)皮祖細胞中TLRs及細胞因子的表達;細胞計數(shù)法檢測細胞的數(shù)量變化;Annexin V-PI檢測LPS作用下EPCs的凋亡情況;RT-PCR及流式細胞分析法檢測EPCs細胞表面標(biāo)記(AC133、CD34、KDR)的變化;Western blot檢測LPS作用下信號傳導(dǎo)通路中MAPK家族Erk、P38、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化情況。 結(jié)果: 1、RT-PCR結(jié)果顯示早期EPCs中表達除TLR7以外所有的TLRs,進一步流式細胞分析證實EPCs表面表達CD14、TLR2和TLR4。在LPS刺激下EPCs表達IL—8、IFN-α、IFN-β、TNFα。 2、細胞計數(shù)法結(jié)果顯示LPS(100ng/ml)作用下EPCs數(shù)量明顯增加(P＜0.01);Annexin V-PI染色分析發(fā)現(xiàn)LPS對EPCs的凋亡沒有影響。 3、RT-PCR及流式細胞分析結(jié)果顯示EPCs細胞表面標(biāo)記AC133、CD34表達上調(diào),而KDR表達無明顯變化。 4、Western blot結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)TLR4信號傳導(dǎo)中MAPK家族中Erk、P38、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的磷酸活化。 結(jié)論: 1、發(fā)現(xiàn)早期內(nèi)皮祖細胞表達有生物學(xué)活性的TLRs,而TLR4在內(nèi)皮祖細胞中高表達。 2、活化的TLR4不誘導(dǎo)細胞凋亡,而誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞生長。 3、內(nèi)皮祖細胞的生長是LPS通過激活TLR4信號通路,最終激活NF-κB和MAPK信號傳導(dǎo)所致。 第二章ADMA對人臍血內(nèi)皮祖細胞的影響及機制研究 第一節(jié)循環(huán)內(nèi)皮祖細胞與ADMA在冠心病患者中的檢測及相關(guān)性分析 目的:探討冠心病患者中循環(huán)內(nèi)皮祖細胞與非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)的關(guān)系及臨床意義。 方法:50例冠心病患者均經(jīng)選擇性冠狀動脈造影證實有明顯的冠狀動脈狹窄;30例對照組經(jīng)臨床檢查和選擇性冠狀動脈造影排除冠心病。根據(jù)病變程度分組,測定各組患者血漿ADMA水平;采集研究對象外周血進行內(nèi)皮祖細胞的分離培養(yǎng),7—10天后倒置相差顯微鏡下計數(shù)細胞克隆形成單位(CFU)評估循環(huán)內(nèi)皮祖細胞水平。 結(jié)果: 1、冠心病多支病變組血漿ADMA水平明顯高于對照組(P＜0.01),Gensini積分≥60組血漿ADMA水平明顯高于對照組; 2、冠心病組中多支病變組循環(huán)內(nèi)皮祖細胞水平明顯低于對照組(P＜0.01);Gensini積分≥60組循環(huán)內(nèi)皮祖細胞水平顯著低于對照組(P＜0.01)。血清ADMA與循環(huán)內(nèi)皮祖細胞水平呈負相關(guān)(r=-0.416,P＜0.01)。 結(jié)論: 1、隨著冠心病病變程度的增加,體內(nèi)ADMA濃度逐漸增加,而EPCs逐漸減少,冠心病的發(fā)生和ADMA的蓄積和EPCs的減少相關(guān)。 2、體內(nèi)ADMA濃度和EPCs的數(shù)量呈負相關(guān),ADMA的增加可能導(dǎo)致循環(huán)EPCs數(shù)量的減少,ADMA通過何種機制影響體內(nèi)EPCs的數(shù)量,尚待進一步研究。 第二節(jié)ADMA對人臍血早期內(nèi)皮祖細胞增殖影響及L-精氨酸的作用 目的:研究非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)對人臍帶血內(nèi)皮祖細胞增殖的影響,觀測L-精氨酸(L-arg)對ADMA的拮抗作用,并探討其機制。 方法:從臍帶血中分離出單個核細胞,體外培養(yǎng)7天,在貼壁細胞中加入不同濃度的非對稱性二甲基精氨酸(1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l)作用不同時間(24、48、72小時),用MTT比色實驗和細胞克隆形成單位(CFU)計數(shù)的方法評價ADMA對EPCs增殖的影響;同時,加入L-精氨酸后采用MTT比色實驗和高倍熒光顯微鏡下DiI-acLDL染色細胞計數(shù)法分析L-精氨酸對ADMA作用內(nèi)皮祖細胞的影響;細胞隨機分5組:對照組,ADMA組,ADMA+L-精氨酸組,ADMA+吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)組,L-精氨酸組。運用熒光染料檢測細胞活性氧的產(chǎn)生。逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)檢測還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶亞基及細胞內(nèi)抗氧化劑超氧化物歧化酶(MnSOD)mRNA變化。硝酸還原酶法測定培養(yǎng)液上清液一氧化氮(NO)的含量,采用化學(xué)比色法測定培養(yǎng)液上清液總一氧化氮合酶(NOS)活力。 結(jié)果: 1、ADMA呈量效和時效性的減少內(nèi)皮祖細胞數(shù)目和增殖能力,抑制NOS活性,降低NO水平: 2、隨著L-精氨酸濃度的增加,L-精氨酸能有效拮抗ADMA對內(nèi)皮祖細胞增殖的抑制作用,同樣,L-精氨酸能通過拮抗ADMA,增強NOS活性,增加NO水平。 3、ADMA顯著增加細胞內(nèi)活性氧的生成;L-精氨酸和抗氧化劑PDTC能抑制ADMA刺激后的細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生。 4、ADMA誘導(dǎo)NADPH氧化酶p22phox亞基、gp91phox亞基mRNA的表達明顯上調(diào),L-精氨酸和抗氧化劑(PDTC)能抑制這些基因的上調(diào)。 5、ADMA對抗氧化酶MnSOD mRNA表達沒有影響。 結(jié)論: 1、ADMA通過減少NO的生成,增加內(nèi)皮祖細胞內(nèi)活性氧生成,上調(diào)NADPH氧化酶表達,抑制人臍血內(nèi)皮祖細胞的增殖,影響內(nèi)皮祖細胞的內(nèi)皮再生功能。 2、外源性的L-精氨酸能拮抗ADMA對EPCs增殖的抑制作用,抑制細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),起到保護內(nèi)皮祖細胞的作用,從而保護內(nèi)皮功能。 3、ADMA誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和抗氧化酶MnSOD無關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 朱登納;賈延R，

本文編號：1588412