本文選題：間充質干細胞　切入點：脂肪細胞　出處：《復旦大學》2009年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 肥胖的產生不僅是由于脂肪細胞增大引起的,還有另外一個重要因素是脂肪細胞數(shù)目的增加。脂肪細胞數(shù)目的增多來源于存在于脂肪組織內多潛能干細胞的成脂分化,甚至在某些因素的刺激下,其它器官的干細胞如骨髓間充質干細胞也可能會募集到脂肪組織分化為脂肪細胞。目前對于脂肪細胞分化的研究主要集中于小鼠前脂肪細胞到成熟脂肪細胞這個階段,但是對于間充質干細胞特別是人來源的間充質干細胞如何分化為脂肪細胞這一過程了解甚少。因此,本課題研究的主要目的是觀察人骨髓間充質干細胞分化為脂肪細胞過程中的基本特征,包括增殖特性和參與調控的轉錄因子的作用。 本課題中,我們利用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)的方法從人骨髓中成功分離了間充質干細胞。從形態(tài)上觀察,體外培養(yǎng)的人骨髓間充質干細胞成梭形,生長比較緩慢,細胞缺乏接觸抑制的特性,生長致密的克隆中心細胞成多層生長。流式細胞檢測90%以上的細胞處以G0／G1期。人骨髓間充質在體外只能進行有限傳代,多次傳代后細胞出現(xiàn)復制性老化,大概能傳至第12代。 進一步我們用含10%胎牛血清,0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-l-methylxanthine, Mix), 1μM地塞米松(Dexamethasone, Dex),10μg/ml胰島素(Insulin), 100μM吲哚美辛(Indo, Indomethacin)的培養(yǎng)液誘導細胞。按照MDI+Indo處理3天,接著胰島素維持1天,如此反復處理細胞至12天,最后用僅含胰島素的培養(yǎng)液維持至21天。細胞經誘導后絕大多數(shù)細胞分化為成熟的脂肪細胞,表現(xiàn)為細胞胞體由原來的梭形變?yōu)閳A形,細胞內有甘油三酯聚積。同時用Real-time PCR的方法檢測脂肪細胞特異性蛋白質脂肪酸結合蛋白(422／aP2)隨分化的過程表達增加。另外,脂肪細胞分化密切相關的轉錄因子C/EBPβ在激素誘導過程中并沒有顯著變化,至分化后期有所下降。C/EBPα和PPARγ激素處理后表達增加。 以往的研究表明接觸抑制的小鼠3T3-L1細胞分化時會重新進入細胞周期(MCE, mitotic clonal expansion有絲分裂克隆擴增),我們的研究發(fā)現(xiàn)人脂肪組織干細胞成脂分化時沒有經歷MCE。在我們的研究中,人骨髓間充質干細胞因為其生長特性,細胞在分化之前不能接觸抑制和同步化,分化前后細胞計數(shù)結果表明,細胞分化處理結束后,未處理的對照組細胞數(shù)量相對誘導分化前還有一定量增加,而分化處理組的細胞數(shù)量少于對照組,并且刺激次數(shù)越多,分化細胞的比例越高,最終細胞數(shù)量與未誘導組相比增加越少。提示細胞分化時沒有經過分裂。進一步我們在人骨髓間充質干細胞誘導分化24小時后加入BrdU孵育48小時,到細胞分化成熟后檢測BrdU摻入和分化脂肪細胞的關系,結果顯示有部分細胞摻入BrdU,說明這些細胞還在增殖,但這些細胞均沒有分化為脂肪細胞,胞漿內沒有脂滴出現(xiàn)；而有脂滴積聚的脂肪細胞其核內均沒有BrdU摻入。對照的3T3-L1可見絕大多數(shù)分化的細胞有BrdU摻入。這些結果提示,人骨髓間充質干細胞與小鼠前脂肪細胞3T3-L1不同,分化時并不需要經過有絲分裂克隆擴增的調節(jié)過程。 人骨髓間充質干細胞中C/EBPβ的表達量在激素處理的過程中并沒有顯著的變化。但是當我們用RNA干擾的方法敲低C/EBPβ的表達后,細胞成脂分化能力顯著降低,提示C／EBPp在人骨髓間充質干細胞分化為脂肪細胞的過程中是必須的。進一步我們利用腺病毒過表達系統(tǒng)在細胞內過表達C/EBPβ,觀察到C/EBPβ聯(lián)合PPARγ的激動劑吲哚美辛使脂肪細胞的分化增加,說明C/EBPβ可以促進人骨髓間充質干細胞向脂肪細胞分化,但必須依賴PPARγ的激活。過表達C/EBPα對細胞分化的影響類似于C/EBPβ的作用,可以促進細胞向脂肪細胞分化,但必須同時激活PPARγ。但是在相同MOI情況下,C/EBPα促進細胞成脂分化的作用小于C/EBPβ的作用。另外隨著MOI的升高,C/EBPβ和C/EBPα均表現(xiàn)出抗細胞增殖和促進凋亡的作用。骨髓間充質干細胞過表達PPARγ能夠促使細胞分化,并且不需要激素MDI的作用,加入PPARγ的激動劑能夠增強這種效果。但是PPARγ的過表達和激活后分化細胞內的脂滴明顯小于用MDI+Indo誘導分化的細胞,提示PPARγ可能起始了脂肪細胞的分化但是脂質代謝還需要其它基因激活參與。另外過表達PPARγ使微絲蛋白β-actin的表達降低,但不影響β-tubulin的表達,提示PPARγ可能通過調節(jié)細胞骨架蛋白調節(jié)脂肪細胞的分化。 我們對于人骨髓間充質干細胞分化為脂肪細胞過程中的基本特征和參與調節(jié)脂肪分化的三個轉錄因子C/EBPβ、C/EBPα和PPARγ的作用進行了初步探討,至于它們通過何種方式調節(jié)脂肪細胞的分化還需要進一步實驗和研究。這對于闡明人脂肪細胞分化機制,指導肥胖以及其相關疾病的治療具有積極的意義。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【引證文獻】

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本文編號：1580707