本文選題：晚期氧化蛋白產(chǎn)物　切入點：慢性腎衰　出處：《第三軍醫(yī)大學》2009年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products,AOPPs)是Witko-Sarsat等于1996年首先報道的由尿毒癥血液透析(Hemodialysis,HD)患者血漿中分離出的含有雙酪氨酸結構的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物,系因患者體內過高的氧化應激水平導致各種蛋白質氧化損傷所形成的終末產(chǎn)物的總稱�，F(xiàn)已明確,AOPPs是一類炎癥介質,能夠激活單核細胞,刺激TNF-α、IL-6、IL-1等炎性因子的合成釋放,促發(fā)單核細胞的炎癥效應,是HD患者免疫功能紊亂、加速性動脈粥樣硬化、透析相關性淀粉樣變等長期并發(fā)癥的重要致病環(huán)節(jié)。血漿中的AOPPs主要分為高分子量(約670kD)和低分子量(約70kD)兩種形式,高分子量AOPPs是氧化白蛋白的聚合體,在HD患者中起主要作用的是高分子量的AOPPs,在本文中我們主要研究高分子量AOPPs。AOPPs一旦形成即不可逆,因其分子量大,目前各種透析模式均不能有效清除,成為HD患者的長期并發(fā)癥的重要致病因素,嚴重影響依賴性透析病人的長期生存率和生存質量。目前AOPPs的檢測主要是利用AOPPs在340nm波長有紫外吸收峰,以在同一波長有紫外吸收峰的氯胺-T作為替代品來定量檢測,因氯胺T是一種有機化合物,并不能真實反映體內的AOPPs水平,缺乏特異性,容易出現(xiàn)假陽性。且該方法操作步驟煩瑣,需13000rpm離心1小時,易受血脂、膽紅素、溶血、藥物的影響。近年的文獻報道,高速離心后HD患者血清AOPPs值明顯較未離心的AOPPs值低,且所測值與氧化應激的另一指標8-oxo-dG無關聯(lián),采用去脂劑沉淀甘油三酯后發(fā)現(xiàn),所測AOPPs值較未用去脂劑前下降51%,但無論是高速離心還是去脂劑沉淀甘油三酯后,HD患者體內的AOPPs仍明顯高于正常,特異、準確檢測血漿AOPPs顯得非常重要。 研究表明,AOPPs與疾病的嚴重程度和疾病的預后相關。因此,應用AOPPs抗體通過免疫組化、ELISA、western blot等方法觀察AOPPs在病變組織或體液中的表達情況對相關疾病的診斷、療效觀察、預后等具有重要意義。AOPPs可通過沉積于血管、組織而加重動脈粥樣硬化,透析相關性淀粉樣變,運用其相應抗體有可能阻斷AOPPs的作用,從而為AOPPs的毒性作用提供一種新的治療途徑。另外,借助抗體與抗原特異性結合的特性,也可以將AOPPs抗體偶聯(lián)透析器上,從而發(fā)揮靶向治療的作用。為進一步研究AOPPs結合蛋白甚至受體奠定了堅實的基礎。由上可見,AOPPs抗體具有廣泛的應用前景和潛在的應用價值。目前,國內外仍無商品化的AOPPs抗體及這方面的研究報道�？贵w制備中最關鍵的環(huán)節(jié)是制備的抗原一定要純。目前國內外主要采用人血白蛋白(human serum albumin,HSA)與次氯酸(HOCl)孵育體外制備AOPPs-HSA作為研究的對象,它具備與體內AOPPs同樣的生物學活性,但是這樣制備出的AOPPs-HSA成分并不單一,能夠滿足生物學功能研究的要求,但卻不適合抗體制作。凝膠層析是以各種凝膠為固定相,利用流動相中各組分的相對分子量不同而達到分離的一種層析方法。本文研究的重點是大分子量的AOPPs,Hitrap 26/60 sephacryl S-300 high Resolution是一種由分子量為4～20×104的葡聚糖交聯(lián)聚合而成的葡聚糖凝膠,適于大分子的分離,其分離范圍為10KD～1500KD�，F(xiàn)有文獻報道,AOPPs是一組不同分子量的復合物,為保證抗原的純度及篩選到的抗體具有特異性,我們在免疫動物時取AOPPs-HSA純化后的第一峰作為免疫原,制備AOPPs單克隆抗體,并以純化后第一峰作為篩選抗體的檢測源(以后在本文中免疫動物、篩選抗體的檢測源、抗體特異性鑒定采用的AOPPs-HSA均為AOPPs-HSA純化后的第一峰)。 綜上所述,本研究的目的是采用HSA與HOCl孵育體外制備AOPPs,通過葡聚糖凝膠Hitrap 26/60 sephacryl S-300得到AOPPs的相對純品,取純化后的第一峰作為免疫原,并以純化后第一峰作為篩選抗體的檢測源,制備AOPPs的單克隆抗體,建立抗體工作平臺,應用AOPPs抗體通過Western blot、ELISA等方法觀察AOPPs在病變組織或體液中的表達情況,對相關疾病的診斷、療效觀察、預后提供依據(jù)等。另外,為用抗體中和AOPPs毒性、將AOPPs抗體偶聯(lián)透析器上,發(fā)揮靶向性治療作用以及AOPP結合蛋白甚至受體的研究打下堅實的基礎。 方法: 1.首先通過葡聚糖凝膠Hitrap 26/60 sephacryl S-300 high Resolution純化HSA,經(jīng)變性、非變性電泳確定純化后白蛋白的分子量及純度。取純化的HSA與HOCL孵育體外制備AOPPs-HSA,再用Hitrap 26/60 sephacryl S-300純化AOPPs-HSA。經(jīng)變性、非變性電泳、分子篩蛋白標準確定純化后AOPPs-HSA的分子量。并經(jīng)單核細胞株(THP-1)TNF-α分泌實驗鑒定,純化后的AOPPs-HSA能否刺激單核細胞分泌TNF-α,促發(fā)單核細胞炎癥反應的活性。 2.經(jīng)Sephacryl S 300柱純化后AOPPs-HSA分為6個峰,取純化后的AOPPs-HSA第1峰作為免疫原,免疫BALB/c小鼠,采用雜交瘤技術制備抗AOPPs-HSA的McAb,用純化的AOPPs-HSA和HSA分別作為篩選抗體的檢測源,選擇與AOPPs-HSA反應呈強陽性而與HSA呈陰性的克隆,同時也選擇與AOPPs-HSA和HSA反應呈強陽性克隆。亞類鑒定采用Sigma公司的免疫球蛋白標準亞類鑒定試劑盒。用Protein G柱純化抗體。SDS-PAGE鑒定抗體的純度。用間接ELISA、western blot鑒定抗體特異性。 3.標記單克隆抗體,采用其中一株作為包被抗體,辣根過氧化物酶標記的另一株作為標記抗體,通過配對試驗,篩選出最佳配對,建立雙抗體夾心法用于定量檢測人AOPPs抗原含量。優(yōu)化包被抗體和酶標抗體的最適宜工作濃度,并進行準確度、精密度、線性范圍、檢測限等方法學評價試驗。 4.用此檢測系統(tǒng)檢測36例正常人,18例慢性腎衰但沒有透析的患者及56例透析患者之間血清AOPPs含量有無區(qū)別,并與分光光度計檢測的AOPPs比較。觀察離心前后兩種檢測方法對AOPPs的影響,比較分光光度計法與雙抗夾心法對AOPPs檢出陽性率以及AOPPs與臨床其它指標的相關性。 結果: 1.經(jīng)Hitrap 26/60 sephacryl S-300 high Resolution純化后HSA后分為3個峰,第三峰無論是變性電泳還是非變性電泳均只有一條帶且此條帶的分子量在55～72KD之間。表明從PAGE及SDS-PAGE看,經(jīng)純化后峰3為單一分子量的蛋白質,且其分子量約為67KD。用此純化的HSA與HOCL孵育體外制備AOPPs-HSA并經(jīng)Sephacryl S 300柱純化后分為6個峰,PAGE及SDS-PAGE結果表明純化后的1、2、3、4峰表現(xiàn)為膠頂部的復合物,說明我們在制作AOPPs的過程中用的白蛋白是比較純的,而經(jīng)過HOCL處理后白蛋白發(fā)生了結構上的變化,變成了一個大分子的結構,故出現(xiàn)在膠的頂部。但非變性電泳膠頂部的條帶比變性電泳明顯的多,而在變性電泳中,1、2、3、4峰在55～72KD處出現(xiàn)了比較明顯的條帶,說明此大分子的結構在變性電泳時會有部分解聚,變成55～72KD之間的蛋白,即解聚成白蛋白的單體,但大部分仍沒有解聚。分子篩蛋白標準鑒定其分子量為670KD。 2.經(jīng)以上制備及純化后AOPPs-HSA第一峰用分光廣度計法檢測其AOPPs含量為20.38μmol/l,遠遠高于對照HSA樣本的3.14μmol/l。用純化后的AOPPs-HSA可顯著性誘導THP-1 TNF-a的分泌,未經(jīng)氧化修飾的HSA對THP-1的分泌沒有顯著性影響。時間效應顯示AOPPs-HSA刺激6小時,THP-1 TNFa的分泌量就已顯著性升高,12h升至最高水平。 3.取純化后的AOPPs-HSA第1峰免疫BALB /c小鼠,共獲得3株穩(wěn)定分泌特異性抗AOPPs的單克隆雜交瘤細胞株,分別命名為1-C6、1-H1、3-A10,1株既抗HSA又抗AOPPs,命名為1-C5。亞類鑒定1-C5、1-C6、1-H1為IgG1, 3-A10株為IgG2b。間接ELISA交叉反應性分析顯示,其中1-C5既與AOPPs又與HSA特異結合,其余三株均只與AOPPs特異結合,而與AOPPs-BSA、BSA、CD26親和力低,經(jīng)統(tǒng)計學分析,均有顯著性差異(p 0. 01)。western blot鑒定表明抗1-H1AOPPs-HSA抗體僅與AOPPs-HSA結合而不與HSA、AOPPs-BSA、AOPPs-RSA結合,且尿毒癥患者血清中AOPPs的水平明顯強于正常人。 4.采用1-H1作為包被抗體,酶標抗體采用1-C5McAb時為最佳配對,成功建立了雙抗夾心法檢測人AOPPs抗原系統(tǒng)。5μg/ml為包被抗體的最佳濃度,1:500為檢測抗體1-C5的最佳工作濃度。對標準曲線、方法檢出限、方法回收率、方法的批內和批間變異進行了分析研究,結果顯示本方法最小檢出限為12 ng/ ml,標準曲線在20～300 ng/ ml范圍內線性良好。批內變異系數(shù)為4.8% ,批間變異系數(shù)為7.17 %,平均加樣回收率為98%,表明該方法準確性高,重復性好,且實驗步驟簡單,容易掌握,其敏感性完全能夠滿足臨床應用的需要。 5.分別用雙抗夾心法、分光光度計法檢測36例正常人,18例慢性腎衰但沒有透析的患者及56例透析患者,發(fā)現(xiàn)HD組和CRF組血漿AOPPs水平顯著高于正常對照組,HD組明顯高于CRF組,P0.001。18例CRF患者用分光光度計法檢出16例高于正常,而用雙抗夾心法僅檢出10例AOPPs高于正常。56例HD患者用分光廣度法檢出51例高于正常,而用雙抗夾心法僅檢出42例高于正常。經(jīng)X2檢驗,具統(tǒng)計學意義。分光光度計檢出AOPPs陽性率明顯高于雙抗夾心法。高速離心后用分光光度計檢測尿毒癥患者血清AOPPs值明顯較未離心的AOPPs值低,而高速離心對雙抗夾心檢測AOPPs無明顯影響。兩種檢測方法呈明顯相關(r=0.543, P0.001, n=110),血漿AOPPs水平與血清肌配水平呈正顯著正相關(r=0.664, P0.001, n=110 ),與尿素氮呈顯著正相關(r=0.606, P0.001, n=110 ),與血色素呈顯著負相關(r=-0.535, P0.001, n=110 )。 結論: 1.經(jīng)Hitrap 26/60 sephacryl S-300 high Resolution純化后獲得了純品HSA,取此純化后的HSA與HOCL孵育體外制備AOPPs-HSA并經(jīng)Sephacryl S 300柱純化后得到相對純品AOPPs-HSA,經(jīng)變性及非變性電泳鑒定表現(xiàn)為大分子的聚合物,經(jīng)分子篩蛋白標準確定其分子量為670kD。此純化蛋白能刺激單核細胞株THP-1分泌TNF-a。 2.取純化后的AOPPs-HSA第1峰免疫BALB /c小鼠,成功篩選出3株穩(wěn)定分泌抗AOPPs-HSA,1株既抗HSA又抗AOPPs-HSA的McAb雜交瘤細胞株。所分泌的抗體亞型3株為IgG1型,1株為IgG2b。間接ELISA和Western blot實驗證明我們制備的抗體可以特異地和天然或經(jīng)HOCL與HSA處理后純化的AOPPs結合。 3.用此單克隆單體配對,建立了雙抗夾心ELISA檢測系統(tǒng),對標準曲線、方法檢出限、方法回收率、方法的批內和批間變異進行了分析研究,表明該方法準確性高,重復性好,且實驗步驟簡單,容易掌握,其敏感性完全能夠滿足臨床應用的需要,可作為反映病人氧化蛋白損傷的一種檢測方法。 4.雙抗夾心ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)HD組和CRF組血漿AOPPs水平顯著高于正常對照組,HD組明顯高于CRF組,P0.001。分光光度計檢出AOPPs陽性率明顯高于雙抗夾心法。經(jīng)X2檢驗,具統(tǒng)計學意義。高速離心后用分光光度計檢測尿毒癥患者血清AOPPs值明顯較未離心的AOPPs值低,而高速離心對雙抗夾心檢測AOPPs無明顯影響。兩種檢測方法具有很好的相關性。鑒于以上結果,我們考慮分光光度計檢出率高的原因可能是由于其缺乏特異性,導致假陽性,但還需要進一步的實驗論證。 5.本實驗首次成功地大量純化AOPPs,制備了其單克隆抗體,建立了AOPPs單克隆抗體的工作平臺,建立了雙抗夾心法檢測人AOPPs系統(tǒng),并應用于臨床。目前國內外均尚未有相關工作的報道。為下一步用抗體中和AOPPs毒性、將AOPPs抗體偶聯(lián)透析器上,發(fā)揮靶向性治療作用以及分離AOPP結合蛋白甚至受體的研究打下堅實的基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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