本文選題：白質(zhì)消失病　切入點(diǎn)：真核細(xì)胞翻譯起始因子2B　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2010年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：elF2B(eukaryotic initiation factor 2B中文名：真核細(xì)胞翻譯起始因子2B)在mRNA的翻譯和調(diào)控中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。eIF2B由5個(gè)亞基(α-ε)構(gòu)成,eIF2Bε是五個(gè)亞基中最大的一個(gè),它包含了負(fù)責(zé)催化eIF2 GDP/GTP互換反應(yīng)的催化結(jié)構(gòu)域。eIF2Bε與eIF2Bγ顯示出巨大的序列相似性,二者形成了一個(gè)催化亞復(fù)合體,這個(gè)催化亞復(fù)合體與eIF2Bα,β和6亞基形成的調(diào)節(jié)亞復(fù)合體形成全復(fù)合體。eIF2B基因突變會(huì)導(dǎo)致一種名為VWM(vanishing white matter disease中文名：腦白質(zhì)消失病)的神經(jīng)系統(tǒng)病變,這種疾病的臨床表型非常多樣。為了有助于我們理解VWM的病因,我們研究了eIF2B復(fù)合體的整合和VWM突變對(duì)eIF2B功能的影響。我們的數(shù)據(jù)顯示,eIF2Bε和eIF2BγN (?)(?)區(qū)域特定的保守殘基對(duì)于這2個(gè)亞基之間以及它們與調(diào)節(jié)亞復(fù)合體之間的相互作用是非常重要的。這個(gè)區(qū)域與核苷酰轉(zhuǎn)移酶蛋白家族顯示出同源性,但是在此類(lèi)蛋白質(zhì)中的保守氨基酸殘基并不是GDP/GTP互換反應(yīng)所必需的。eIF2Bε和γ中的第二個(gè)保守區(qū)域同樣與亞基間的相互作用相關(guān),這個(gè)區(qū)域包含一系列重復(fù)出現(xiàn)的支鏈氨基酸如亮氨酸、異亮氨酸、頡氨酸,eIF2Bε的He 385發(fā)揮了重要的作用。我們還研究了elF2Bβγδε內(nèi)部的一系列VWM突變,這些突變對(duì)eIF2B復(fù)合體的形成和GEF活性都顯示出不同程度的影響,這種多樣性可以幫助我們理解VWM臨床表型的多樣性。具體來(lái)說(shuō)就是：(Ⅰ)一些突變,特別是在催化結(jié)構(gòu)域的突變會(huì)導(dǎo)致活性的降低；(Ⅱ)在催化結(jié)構(gòu)域的VWM突變會(huì)導(dǎo)致eIF2B無(wú)法與其底物結(jié)合；(Ⅲ)與之相對(duì)的是某些VWM突變?nèi)鏥73G反而顯示出增強(qiáng)的活性；(Ⅳ)某些eIF2Bβ,γ或δ的VWM突變對(duì)復(fù)合體形成和GEF活性只有很小的影響或是沒(méi)有影響；(Ⅴ)eIF2Bδ突變A391D和R483W都會(huì)導(dǎo)致先天性疾病,但是他們對(duì)于elF2B復(fù)合體的形成及活性卻有著完全相反的作用(R483W會(huì)嚴(yán)重地影響復(fù)合體形成和GEF活性,而A391D對(duì)兩者都沒(méi)有影響)。因此,在疾病的嚴(yán)重性和突變導(dǎo)致的eIF2B體外生化性質(zhì)改變之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性,某些突變可能會(huì)影響eIF2B的其他功能(目前末知)。這些數(shù)據(jù)擴(kuò)展了我們對(duì)于eIF2B復(fù)合體的結(jié)構(gòu)組織的認(rèn)識(shí),并且有助于我們進(jìn)一步了解這個(gè)關(guān)鍵蛋白因子以及它在VWM中的作用。 mTOR(mammalian target of rapamycin)在細(xì)胞內(nèi)以?xún)煞N不同的復(fù)合體形式存在,即mTORC1和mTORC2。有關(guān)mTORC2的功能研究得還不是很充分,已知的包括調(diào)控細(xì)胞骨架重排,細(xì)胞存活等。mTORC1作為細(xì)胞內(nèi)的中樞調(diào)節(jié)因子參與了多種細(xì)胞進(jìn)程的調(diào)控,如蛋白質(zhì)合成、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期進(jìn)程、自噬、核糖體的生物合成等。核糖體的合成是細(xì)胞分裂過(guò)程中非常重要的,進(jìn)化上高度保守的,需要高度協(xié)調(diào)的復(fù)雜進(jìn)程,對(duì)于細(xì)胞保持合適的增殖速度和穩(wěn)定的細(xì)胞大小是必須的。核糖體的合成需要三個(gè)RNA多聚酶協(xié)同作用才能夠精密地完成,PolⅠ負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄核糖體47S pre-rRNA; PolⅡ負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄核糖體蛋白質(zhì)的(?)nRNA; PolⅢ負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄5s rRNA。mTORC1調(diào)控核糖體的生物合成已經(jīng)成為一個(gè)不爭(zhēng)的事實(shí),對(duì)于其調(diào)控機(jī)制在酵母中研究也取得了令人矚目的成就。在酵母中的研究顯示,TORC1能夠在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭,并且能夠直接和PolⅠ啟動(dòng)子結(jié)合,磷酸化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,直接激活PolⅠ的轉(zhuǎn)錄。類(lèi)似的,TORC1也能夠與TFIIIC結(jié)合磷酸化mafl,解除其對(duì)PolⅢ的抑制,而酵母的核糖體蛋白質(zhì)的表達(dá)也在轉(zhuǎn)錄水平被mTORC1調(diào)節(jié)。人們?cè)噲D在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重復(fù)類(lèi)似的研究,已經(jīng)取得了一些成就,但也發(fā)現(xiàn)了一些與酵母中完全不同的調(diào)控方式：哺乳動(dòng)物mTORC1也在核質(zhì)間穿梭,并且能夠直接與TFIIIC結(jié)合磷酸化MAF1進(jìn)而激活polⅢ的轉(zhuǎn)錄,mTORC1也能夠激活polⅠ的轉(zhuǎn)錄,但是至今沒(méi)有證據(jù)顯示mTORC1能夠直接與polⅠ啟動(dòng)子結(jié)合,磷酸化并激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。而mTORC1對(duì)哺乳動(dòng)物核糖體蛋白質(zhì)的調(diào)控已經(jīng)被證明是在翻譯水平而不是轉(zhuǎn)錄水平,而mTORC1對(duì)于rRNA加工的調(diào)控還不是很清楚。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)mTORC1能夠直接和rRNA加工過(guò)程中的重要蛋白質(zhì)BOP1在體內(nèi)和體外直接的相互作用,而缺乏N端264個(gè)氨基酸的一個(gè)負(fù)顯性突變雖然在體外可以與mTORC1相互作用,但是在體內(nèi)卻不能,暗示細(xì)胞定位對(duì)于其相互作用是必須的。此外,我們發(fā)現(xiàn)BOP1所在的PeBoW復(fù)合體缺陷(siRNA沉默實(shí)驗(yàn)和表達(dá)負(fù)顯性突變實(shí)驗(yàn))能夠作用于mTORC1信號(hào)通路,提高(?)nTORC1下游底物S6K1的磷酸化水平和激酶活性,而不會(huì)影響(?)nTORC1另一底物4EBP1的磷酸化水平,這種只針對(duì)S6K1的特異性調(diào)控與Actinomycin D以及rapamycin的效果類(lèi)似。這暗示mTORC1對(duì)于其下游不同的底物可以以不同的方式進(jìn)行調(diào)控。此外,我們發(fā)現(xiàn)BOP1內(nèi)部有個(gè)mTORC1底物特異性基序--TOS基序,突變這個(gè)基序會(huì)減弱BOP1△的負(fù)顯性表型(對(duì)S6K1的反饋激活,對(duì)rRNA加工的阻斷和對(duì)細(xì)胞周期的抑制)。并且我們發(fā)現(xiàn),這種調(diào)控不像DNA損傷壓力那樣是通過(guò)激活p38MAPK通路激活mTORC1。我們還發(fā)現(xiàn)BOP1是一個(gè)磷酸化蛋白質(zhì),暗示BOP1在翻譯后水平受到某些激酶的調(diào)節(jié),以迅速響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。BOP1S126S127是其磷酸化位點(diǎn)之一,PKA和CKII能夠在體外磷酸化BOP1。我們的結(jié)果顯示mTORC1在rRNA的加工過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用,另外PeBoW復(fù)合體特異性的rRNA加工阻斷會(huì)作用于mTORC1并特異性地激活S6K1,對(duì)十這種現(xiàn)象的生物學(xué)意義還不是很清楚。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1573590