本文關(guān)鍵詞： GFP-V12Rac1 慢病毒載體 NIH3T3細(xì)胞 穩(wěn)定表達(dá) 細(xì)胞遷移　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： Rac1的活性在運(yùn)動細(xì)胞中往往呈現(xiàn)前端富集,這一定位模式對于細(xì)胞運(yùn)動的實(shí)現(xiàn)有著重要作用,但此定位的機(jī)制尚未完全闡明,要對此定位的機(jī)制展開深入研究,首先需要建立穩(wěn)定表達(dá)GFP-V12Rac1的NIH3T3細(xì)胞系。本研究在構(gòu)建GFP-V12Rac1和GFP的質(zhì)粒和慢病毒表達(dá)載體的基礎(chǔ)上,采用慢病毒感染和流式細(xì)胞術(shù)分選的方法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GFP和GFP-V12Rac1的NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞系。我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的目的基因陽性率和表達(dá)水平;通過7-AAD和APC Annexin V雙染和流式細(xì)胞術(shù)檢測的方法確認(rèn)表達(dá)GFP-V12Rac1的NIH3T3細(xì)胞在血清饑餓條件下的生存能力;通過觀察細(xì)胞在I型膠原上的鋪展和細(xì)胞質(zhì)膜皺褶形成來判斷外源表達(dá)GFP-V12Rac1融合蛋白是否具備正常功能,通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞的自發(fā)運(yùn)動和趨化運(yùn)動能力,同時初步檢測了運(yùn)動細(xì)胞中GFP-V12Rac1的定位。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,穩(wěn)定表達(dá)GFP和GFP-V12Rac1的NIH3T3細(xì)胞系在多次傳代后仍然保持目的基因的高陽性率,且兩個細(xì)胞系的平均GFP熒光強(qiáng)度均顯著高于背景熒光強(qiáng)度;7-AAD和APC Annexin V雙染結(jié)果顯示,血清饑餓12h,外源GFP-V12Rac1不影響細(xì)胞的生存能力;鋪展實(shí)驗(yàn)和活細(xì)胞工作站觀測表明,外源GFP-V12Rac1具備促進(jìn)細(xì)胞鋪展和細(xì)胞質(zhì)膜皺褶的能力;細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí),細(xì)胞具備趨化運(yùn)動能力。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,劃痕引發(fā)的細(xì)胞運(yùn)動中,少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)了GFP-V12Rac1的前端定位。本研究結(jié)果表明,慢病毒感染和流式細(xì)胞術(shù)分選是構(gòu)建NIH3T3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的有效途徑,外源表達(dá)的GFP-V12Rac1具備正常功能,構(gòu)建的細(xì)胞系可用于對運(yùn)動細(xì)胞中活化的Rac1進(jìn)行定位觀察。
[Abstract]:The activity of Rac1 tends to be preferentially enriched in the motor cells. This localization model plays an important role in the realization of cell movement. However, the mechanism of this localization has not been fully clarified, and the mechanism of this localization should be deeply studied. Firstly, we need to establish a stable NIH3T3 cell line expressing GFP-V12Rac1. Based on the construction of GFP-V12Rac1 and GFP plasmids and lentivirus expression vectors, The fibroblasts of NIH3T3 mice expressing GFP and GFP-V12Rac1 stably were constructed by lentivirus infection and flow cytometry. The positive rate and expression level of target genes in stable expression cell lines were detected by flow cytometry. The viability of NIH3T3 cells expressing GFP-V12Rac1 was confirmed by using 7-AAD and APC Annexin V double staining and flow cytometry. The expression of GFP-V12Rac1 fusion protein was evaluated by observing cell spreading on type I collagen and the formation of cytoplasmic membrane fold. The ability of spontaneous and chemotaxis of cells was studied by cell migration experiment. At the same time, the localization of GFP-V12Rac1 in motor cells was preliminarily detected. The results of flow cytometry showed that the NIH3T3 cell lines stably expressing GFP and GFP-V12Rac1 maintained the high positive rate of the target gene after repeated passages. The average GFP fluorescence intensity of the two cell lines was significantly higher than that of background fluorescence intensity 7-AAD and APC Annexin V. The results showed that exogenous GFP-V12Rac1 did not affect the viability of the cells after 12h of serum starvation. Exogenous GFP-V12Rac1 has the ability to promote cell spreading and cytoplasmic membrane fold. Cell migration experiments have proved that cells have chemotaxis ability. The results of scratch test suggest that in the cell movement induced by scratch, The results of this study indicate that lentivirus infection and flow cytometry are effective ways to construct stable expression cell lines of NIH3T3, and exogenous GFP-V12Rac1 has normal function. The constructed cell line can be used to localize activated Rac1 in motor cells.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

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