本文關(guān)鍵詞： 促�；鞍� 脂滴相關(guān)蛋白 脂代謝 脂肪細(xì)胞 促�；鞍� 磷脂酶C U73122 脂滴相關(guān)蛋白 脂肪細(xì)胞 脂代謝 促酰化蛋白 磷酯酰肌醇3激酶 wortmannin 脂滴相關(guān)蛋白 脂肪細(xì)胞 脂代謝　出處：《華中科技大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 第一部分促�；鞍讓�(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化進(jìn)程中脂滴相關(guān)蛋白adipophilin、perilipin和TIP47表達(dá)的影響 研究背景：隨著研究深入，脂肪組織為一個(gè)活躍內(nèi)分泌器官的觀念，已被大多數(shù)學(xué)者所接受。越來(lái)越多的研究表明，脂肪細(xì)胞可以產(chǎn)生多種特異性或非特異性的脂肪因子(adipocytokine)，如促�；鞍�(acylationg stimulating protein，ASP)、脂聯(lián)素(adiponectin)、抵抗素(resistin)、瘦素(leptin)、腔脂素(visfatin)等，這些因子通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌或自分泌的生物學(xué)作用方式，在調(diào)節(jié)糖、脂代謝及維持能量平衡中發(fā)揮重要作用。ASP是一種來(lái)源于補(bǔ)體系統(tǒng)的脂肪因子，目前關(guān)于ASP的研究主要集中在調(diào)節(jié)糖、脂代謝方面。ASP的生物學(xué)作用包括：刺激脂肪細(xì)胞甘油三酯合成(TGS)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)并抑制脂肪分解。ASP具備與胰島素相互疊加而又相對(duì)獨(dú)立的生物學(xué)效應(yīng)。ASP對(duì)餐后甘油三酯(TG)的清除具有重要作用。肥胖及其相關(guān)代謝紊亂性疾病包括2型糖尿病、冠心病、高血壓等，血漿ASP水平升高，且與體重指數(shù)、血脂密切相關(guān)；而體重下降和運(yùn)動(dòng)鍛煉可使升高的血漿ASP明顯下降。脂滴(Lipiddroplets)又稱脂肪小體，是脂肪細(xì)胞儲(chǔ)存TG的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。近年來(lái)脂滴相關(guān)蛋白(lipiddroplets associated protein)的發(fā)現(xiàn)，使人們認(rèn)識(shí)到脂滴不僅是能量的儲(chǔ)存庫(kù)，還是活躍的脂質(zhì)代謝池，是具有獨(dú)立功能的細(xì)胞器，參與胞內(nèi)運(yùn)輸和脂質(zhì)代謝。Perilipin、adipophilin、TIP47作為PAT家族蛋白的重要成員，不僅僅在脂滴的快速合成、新生脂滴的穩(wěn)定、脂滴的成熟以及脂滴在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)位中發(fā)揮作用，還參與了多種病理過(guò)程的發(fā)生和發(fā)展，脂滴的過(guò)度異位沉積于巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞內(nèi)，將使其轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，是形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的初始環(huán)節(jié)。 目的：本文旨在通過(guò)觀察分化過(guò)程中促�；鞍�(acylation stimulating protein，ASP)對(duì)脂滴相關(guān)蛋白adipophilin、perilipin和TIP47表達(dá)的影響，探討adipophilin、perilipin和TIP47在介導(dǎo)ASP促成脂過(guò)程中的作用。 方法：體外培養(yǎng)小鼠來(lái)源的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，經(jīng)典激素雞尾酒法誘導(dǎo)分化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期工作驗(yàn)證的adipophilin、perilipin和TIP47基因和蛋白水平的時(shí)序性變化規(guī)律選取幾個(gè)代表性的作用時(shí)間點(diǎn)，設(shè)立ASP(1μmol／L)刺激組、胰島素(100 nmol／L)刺激組及空白對(duì)照組： (1)[~3H]油酸摻入法測(cè)定不同刺激狀態(tài)下脂肪細(xì)胞甘油三酯合成率； (2)[~3H]-2-脫氧葡萄糖([~3H]-2-DG)摻入法測(cè)定不同刺激狀態(tài)下脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率； (3)RT-PCR方法檢測(cè)adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA表達(dá)； (4)Western blot方法檢測(cè)adipophilin、perilipin和TIP47蛋白表達(dá) 結(jié)果： (1)脂肪細(xì)胞分化第3天和第6天，ASP組甘油三酯合成率顯著高于空白對(duì)照組(P＜0．05，P＜0．01)，胰島素組各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)甘油三酯合成率與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異； (2)脂肪細(xì)胞分化第6天和第9天，ASP組和胰島素組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率均較同期空白對(duì)照組顯著增加(P＜0．05，P＜0．01)，其增加效應(yīng)，胰島素組較ASP組更為顯著(P＜0．05，P＜0．001)； (3)與空白對(duì)照組相比，ASP組adipophilin基因和蛋白表達(dá)水平從0天起顯著升高(P＜0．05，P＜0．001)，第4天以后無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ASP組perilipin基因和蛋白表達(dá)水平從第3天起顯著升高(P＜0．05，P＜0．001)，直至完全分化成熟(第9天)，仍顯著高于同期正常組(P＜0．05)，ASP組TIP47基因和蛋白表達(dá)有顯著的上調(diào)作用，但隨著分化至48h此上調(diào)作用已不明顯； (4)胰島素組adipophilin和perilipin基因和蛋白表達(dá)水平均與同期對(duì)照組相比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，胰島素僅在分化的0d對(duì)脂肪細(xì)胞中TIP47 mRNA和蛋白表達(dá)有上調(diào)作用，之后基本無(wú)影響。 結(jié)論：ASP組adipophilin、perilipin和TIP47的表達(dá)與脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中ASP促進(jìn)甘油三酯合成之間具有顯著相關(guān)性，ASP可能通過(guò)調(diào)節(jié)adipophilin、perilipin和TIP47基因和蛋白的表達(dá)影響脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚積和脂滴形成。 第二部分PLC信號(hào)途徑參與促�；鞍渍{(diào)節(jié)脂滴相關(guān)蛋白的基因／蛋白表達(dá) 背景：磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)為磷脂酰肌醇信號(hào)通路的關(guān)鍵酶，在機(jī)體內(nèi)分布極廣。諸多細(xì)胞外信息分子，如激素、免疫球蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等，均可激活磷脂酰肌醇特異性PLC。活化的PLC水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)，產(chǎn)生兩種重要的第二信使：二酯酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，進(jìn)而將細(xì)胞外的信息傳遞給下游的效應(yīng)分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生命活動(dòng)。近期ASP功能性受體C5L2的發(fā)現(xiàn)、純化和鑒定，將ASP在脂代謝領(lǐng)域的研究又大大推進(jìn)，并證實(shí)PLC途徑是ASP／C5L2的重要信號(hào)通路。 目的：本文旨在觀察阻斷細(xì)胞PLC信號(hào)途徑后，促�；鞍�(acylation stimulating protein，ASP)對(duì)脂滴相關(guān)蛋白adipophilin、perilipin和TIP47表達(dá)影響的變化，探討ASP對(duì)脂滴相關(guān)蛋白adipophilin、perilipin和TIP47的調(diào)控是否有PLC信號(hào)機(jī)制的參與。 方法：體外培養(yǎng)小鼠來(lái)源的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，經(jīng)典激素雞尾酒法誘導(dǎo)分化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期工作驗(yàn)證的adipophilin、perilipin和TIP47基因和蛋白水平的時(shí)序性變化規(guī)律選取幾個(gè)代表性的作用時(shí)間點(diǎn)，設(shè)立ASP(1μmol／L)刺激組、U73122(5μmol／L)處理組、U73122(5μmol／L)預(yù)處理+ASP(1μmol／L)刺激組及空白對(duì)照組： (1)RT-PCR方法檢測(cè)adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA表達(dá)變化： (2)Western blot方法檢測(cè)adipophilin、perilipin和TIP47蛋白表達(dá)變化 結(jié)果： (1)PLC信號(hào)途徑阻斷劑U73122對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化特定時(shí)期內(nèi)adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA和蛋白表達(dá)有顯著的下調(diào)作用： ①與同期正常對(duì)照組相比，U73122干預(yù)組adipophilin mRNA水平于分化第0天，第3天，第6天和第9天均顯著下降(P＜0．05，P＜0．01，P＜0．001)adipophilin蛋白水平于分化第0天，第1天，第3天和第4天顯著下調(diào)(P＜0．05)； ②與同期正常對(duì)照組相比，U73122干預(yù)組perilipin mRNA水平在分化起始點(diǎn)時(shí)稍下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，分化第3天，第6天和第9天均明顯下調(diào)(P＜0．05)：perilipin蛋白水平于分化第3天，第4天，第6天和第9天分別下降(P＜0．05，P＜0．01)； ③與同期正常對(duì)照組相比，U73122干預(yù)組TIP47 mRNA及蛋白水平于分化第0天，第12小時(shí)，第1天和第2天均明顯下調(diào)(P＜0．05，P＜0．01) (2)U73122能顯著抑制ASP對(duì)adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA和蛋白的上調(diào)效應(yīng)，但并不能完全阻斷上述效應(yīng)。 ①與單一ASP刺激組相比，U73122預(yù)處理后加ASP刺激組adipophilinmRNA水平于分化第0天，第3天，第6天和第9天均顯著下降(P＜0．05，P＜0．01)：adipophilin蛋白水平于分化第0天，第1天，第3天和第4天和第6天均顯著下調(diào)(P＜0．05)； ②與單一ASP刺激組相比，U73122預(yù)處理后加ASP刺激組perilipinmRNA水平于分化第3天，第6天和第9天顯著下調(diào)(P＜0．05，P＜0．01)；perilipin蛋白水平僅在分化第4～6天時(shí)明顯下調(diào)(P＜0．05)，其它時(shí)點(diǎn)均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； ③與單一ASP刺激組相比，U73122預(yù)處理后加ASP刺激組TIP47mRNA水平TIP47 mRNA及蛋白水平于分化第0天，第12小時(shí)，第1天和第2天均明顯下調(diào)(P＜0．05，P＜0．01) 結(jié)論：PLC信號(hào)途徑參與介導(dǎo)ASP對(duì)adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA和蛋白的上調(diào)效應(yīng)，但并非其唯一信號(hào)機(jī)制。 第三部分PI3K信號(hào)途徑參與促酰化蛋白調(diào)節(jié)脂滴相關(guān)蛋白的基因／蛋白表達(dá) 背景：磷酯酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)家族，為生長(zhǎng)因子超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要分子，能被多種細(xì)胞因子和理化因素激活，是一類特異性催化磷酯酰肌醇(phos-phatidylinositol，PI)的3位羥基磷酸化，并產(chǎn)生具有第二信使作用的肌醇脂物質(zhì)的激酶，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡及細(xì)胞代謝等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Wortmannin是一種霉菌的代謝產(chǎn)物，也是PI3K特異性的抑制劑，最初由Penicillium-wortmannii分離得到，能夠不可逆性地抑制PI3K的活性。有研究報(bào)道，PI3K抑制劑wortmannin和LY294002(兩者均阻止脂肪分化)預(yù)處理，可阻斷細(xì)胞內(nèi)adipophilin的表達(dá)。Katherine教授實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)，PI3K途徑是介導(dǎo)ASP／C5L2調(diào)控糖、脂代謝的重要信號(hào)通路。 目的：本文旨在觀察阻斷細(xì)胞PI3K信號(hào)途徑后，促�；鞍�(acylation stimulatingprotein，ASP)對(duì)脂滴相關(guān)蛋白adipophilin、perilipin和TIP47表達(dá)影響的變化，利用PI3K特異性抑制劑wortmannin了解PI3K在ASP對(duì)脂滴相關(guān)蛋白adipophilin、perilipin和TIP47調(diào)控中所起的作用。 方法：體外培養(yǎng)小鼠來(lái)源的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，經(jīng)典激素雞尾酒法誘導(dǎo)分化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期工作驗(yàn)證的adipophilin、perilipin和TIP47基因和蛋白水平的時(shí)序性變化規(guī)律選取幾個(gè)代表性的作用時(shí)間點(diǎn)，設(shè)立ASP(1μmol／L)刺激組、wortmannin(100nmol／L)處理組、wortmannin(100nmol／L)預(yù)處理+ASP(1μmol／L)刺激組及空白對(duì)照組： (1)RT-PCR方法檢測(cè)adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA表達(dá)變化； (2)Western blot方法檢測(cè)adipophilin、perilipin和TIP47蛋白表達(dá)變化 結(jié)果： (1)PI3K信號(hào)途徑阻斷劑wortmannin對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化特定時(shí)期內(nèi)adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA和蛋白表達(dá)有顯著的下調(diào)作用： ①與同期正常對(duì)照組相比，wortmannin干預(yù)組adipophilin mRNA水平于分化第0天，第3天，第6天和第9天均顯著下降(P＜0．01，P＜0．001)adipophilin蛋白水平于分化第0天，第1天，第3天和第4天顯著下調(diào)(P＜0．05，P＜0．01)； ②與同期正常對(duì)照組相比，wortmannin干預(yù)組perilipin mRNA水平在分化第0天，分化第3天，第6天和第9天均明顯下調(diào)(P＜0．05)：perilipin蛋白水平于分化第3天，第4天，第6天和第9天分別下降(P＜0．05)； ③與同期正常對(duì)照組相比，wortmannin干預(yù)組TIP47 mRNA及蛋白水平于分化第0天，第12小時(shí)，第1天和第2天均明顯下調(diào)(P＜0．05，P＜0．01，P＜0．001) (2)Wortmannin能顯著抑制ASP對(duì)adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA和蛋白的上調(diào)效應(yīng)，但并不能完全阻斷上述效應(yīng)。 ①與單一ASP刺激組相比，wortmannin預(yù)處理后加ASP刺激組adipophilinmRNA水平于分化第0天，第3天，第6天和第9天均顯著下降(P＜0．01，P＜0．001)；adipophilin蛋白水平于分化第0天，第1天，，第3天，第4天和第6天顯著下調(diào)(P＜0．05，P＜0．01)； ②與單一ASP刺激組相比，wortmannin預(yù)處理后加ASP刺激組perilipinmRNA水平于分化第3天，第6天和第9天顯著下調(diào)(P＜0．05，P＜0．01)；perilipin蛋白水平從分化第4天起明顯下調(diào)(P＜0．05)； ③與單一ASP刺激組相比，wortmannin預(yù)處理后加ASP刺激組TIP47mRNA水平及蛋白水平于分化第0天，第12小時(shí)，第1天均明顯下調(diào)(P＜0．05，P＜0．01)，兩組mRNA水平自分化第2天時(shí)無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：PI3K信號(hào)途徑參與介導(dǎo)ASP對(duì)adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA和蛋白的上調(diào)效應(yīng)，但并非其唯一信號(hào)機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R362

【參考文獻(xiàn)】

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1 丁振興;王佑民;劉莉;;吡格列酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化過(guò)程中perilipin基因表達(dá)的影響[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2006年08期

2 武陽(yáng)豐,馬冠生,胡永華,李艷平,李賢,崔朝輝,陳春明,孔靈芝;中國(guó)居民的超重和肥胖流行現(xiàn)狀[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2005年05期

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