本文關鍵詞： 血管內(nèi)皮生長因子A 血管生成 抗血管生成治療 兔單克隆抗體 人源化抗體 腎細胞　出處：《浙江大學》2009年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 背景: 血管生成對腫瘤的生長、轉移起到關鍵作用。血管內(nèi)皮細胞生長因子A(VEGF-A)的發(fā)現(xiàn)及對其在病理性血管生成中作用的研究引導了抗VEGF-A藥物在治療腫瘤和其他疾病抗血管治療中的應用。大量研究表明,很多腫瘤中高表達VEGF-A,并與腫瘤的惡性程度及轉移性相關。腎細胞癌(RCC)是一種常見的惡性腫瘤,惡性程度高的腎細胞癌只有有限的治療方法,而且預后較差。這主要由于VHL抑癌基因失活在腎細胞癌中非常常見,從而上調(diào)了VEGF的表達�？贵w具有高特異性和親和力的靶向結合能力,是一種用于治療的理想藥物。至今為止,市場上主要的單克隆藥物均為鼠源性的。兔抗體由于其更高的特異性、親和力及可識別不同的抗原,已經(jīng)廣泛應用于研究和診斷領域。兔抗的這些特性是作為理想的治療性單克隆抗體所必需的。但因為兔抗為多克隆抗體以及鼠單抗的較早開發(fā),關于兔單克隆抗體在治療領域的應用尚未有涉及。從轉基因兔中分離出的漿細胞株作為與兔脾細胞淋巴細胞融合的滋養(yǎng)細胞,使兔雜交瘤及兔單克隆抗體成為可能。 方法: 利用改進的兔雜交瘤技術我們制備了一組抗VEGF-A兔單克隆抗體(RabMAbs)。雜交瘤上清用直接ELISA方法和VEGF/VEGFR2配體受體阻斷ELISA方法篩選。陽性雜交瘤的輕鏈與重鏈基因經(jīng)克隆及表達后,重組抗體用于進一步特征性分析。抗體結合VEGF-A的特異性及親合力用ELISA和BIAcore的方法測定。抑制VEGF誘導的VEGFR2受體磷酸化的作用由Western blotting和定量磷酸化ELISA方法檢測。兔單抗的人源化是在對可變區(qū)的序列及同源性分析的引導下完成的,骨架區(qū)和互補決定區(qū)的非人源的位點均被替換。人源化抗體的體外生物活性通過抑制786-O細胞條件培養(yǎng)的HUVEC細胞生長來測定�？贵w的體內(nèi)抑瘤活性在人腎細胞癌裸鼠模型中驗證。腫瘤標本的微血管密度用CD34免疫組織化學染色并定量。 結果: 共篩選到15個與VEGF-A結合的中和抗體,可以阻斷VEGF-A和受體VEGFR-2的相互作用及KDR/293細胞中VEGF誘導的受體水平磷酸化。這些抗體特異性和人VEGF-A結合,并不與其它VEGF亞型交叉,但其中12個抗體與鼠VEGF有交叉結合。人源化的抗體保持了其來源兔單抗的活性,并具有不同與Bevacizumab的抗原結合表位。細胞水平的實驗中,該抗體可以抑制786-O條件培養(yǎng)基誘導的HUVEC細胞的增殖。我們在人腎細胞癌裸鼠模型中進一步驗證了其抑制腫瘤生長的活性,在給予和Bevacizumab相同劑量和給藥方案時,表現(xiàn)出更好的效果(p＜0.05,0.042);給予低劑量抗體(0.25mg/kg)時,仍然可以明顯降低微血管密度(p＜0.01,0.0085)。 結論: 我們研發(fā)了一個新型的人源化抗VEGF-A抗體可用于治療腫瘤。抗體通過阻斷受體水平的磷酸化,抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖,從而抑制血管生成,發(fā)揮抗腫瘤作用。本實驗也為人源化兔抗應用于治療領域提供了有利證據(jù)。
[Abstract]:Background:. Angiogenesis on the growth of tumors, Metastasis plays a key role. The discovery of vascular endothelial growth factor (VEGF) VEGF-A and its role in pathological angiogenesis have led to the application of anti- VEGF-A drugs in the treatment of tumors and other diseases. VEGF-A is highly expressed in many tumors and is related to the degree of malignancy and metastasis of the tumor. RCCs are a common malignant tumor, and there are only limited treatments for those with high malignancy. And the prognosis is poor. This is mainly due to the fact that VHL suppressor gene inactivation is very common in renal cell carcinoma, which upregulated the expression of VEGF. So far, the major monoclonal drugs on the market are murine. Rabbit antibodies are different because of their higher specificity, affinity and ability to recognize different antigens. Have been widely used in the field of research and diagnosis. These characteristics of rabbit antibodies are necessary for ideal therapeutic monoclonal antibodies. But because rabbit antibodies are polyclonal antibodies and mouse monoclonal antibodies were developed earlier, The application of rabbit monoclonal antibody in the field of treatment has not been involved. The plasma cell lines isolated from transgenic rabbits as trophoblastic cells fused with rabbit splenocyte lymphocytes make it possible for rabbit hybridoma and rabbit monoclonal antibodies to become possible. Methods:. Using the improved rabbit hybridoma technique, we have prepared a group of anti VEGF-A rabbit monoclonal antibody RabMAbs. The supernatant of the hybridoma was screened by direct ELISA method and VEGF/VEGFR2 ligand receptor blocking ELISA method. The light chain and heavy chain genes of the positive hybridoma were cloned and expressed. Recombinant antibodies were used for further characterization analysis. Specificity and affinity of antibody binding to VEGF-A were determined by ELISA and BIAcore methods. Inhibition of VEGFR2 receptor phosphorylation induced by VEGF was detected by Western blotting and quantitative phosphorylation ELISA methods. Humanization of resistance is guided by sequence and homology analysis of variable regions. The biological activity of humanized antibodies in vitro was determined by inhibiting the growth of HUVEC cells conditioned with 786-O cells. The tumor suppressor activity of antibodies in vivo was measured in nude human renal cell carcinoma. The microvessel density of tumor specimens was stained with CD34 immunohistochemical staining and quantified. Results:. Fifteen neutralizing antibodies binding to VEGF-A were screened to block the interaction between VEGF-A and receptor VEGFR-2 and phosphorylation of receptor levels induced by VEGF in KDR/293 cells. These antibodies specifically bind to human VEGF-A and do not intersect with other VEGF subtypes. However, 12 of the antibodies were cross-bound to mouse VEGF. The humanized antibody maintained the activity of rabbit monoclonal antibody derived from the antibody, and had different antigen-binding epitopes with Bevacizumab. This antibody can inhibit the proliferation of HUVEC cells induced by 786-O conditioned medium. We further demonstrated its inhibitory activity on tumor growth in nude mice model of human renal cell carcinoma. The results showed that the microvessel density was significantly decreased when the low dose antibody was given 0.25 mg / kg, and the microvessel density was less than 0.01 mg / kg, P < 0.05g / kg, P < 0.05g / kg, P < 0.05g / kg, P < 0.05g / kg, P < 0.01g / kg, respectively. Conclusion:. We have developed a new humanized anti VEGF-A antibody that can be used to treat tumors by blocking receptor level phosphorylation and inhibiting vascular endothelial cell proliferation, thereby inhibiting angiogenesis. This experiment also provides evidence for the application of humanized rabbit anti-tumor in the field of treatment.
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392;R737.11

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