發(fā)布時(shí)間：2018-02-11 16:06

  本文關(guān)鍵詞： 蓖麻毒素 蓖麻毒素A鏈 中和抗體 計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì) 親和力提高 虛擬篩選 小分子拮抗化合物　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的:蓖麻毒素(ricin)是從植物蓖麻種子中分離得到的一種Ⅱ型核糖體失活蛋白,其A鏈(RTA)為效應(yīng)鏈,通過B鏈(RTB)幾乎可以和所有的真核細(xì)胞結(jié)合。一分子ricin進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),在一分鐘內(nèi)就可以使1777個(gè)核糖體失活,從而很快殺死整個(gè)細(xì)胞。ricin制成粉劑、水溶劑后性質(zhì)穩(wěn)定,經(jīng)呼吸道吸入、消化道攝入和肌肉注射等均可致人中毒,以氣溶膠或肌肉注射對(duì)人的致死劑量估計(jì)為5~10μg/kg體重,其毒性是有機(jī)磷神經(jīng)毒劑VX的385倍,是氰化物的6000倍。ricin生產(chǎn)原料蓖麻籽來源廣泛,提取制備方法簡(jiǎn)便,很容易被恐怖分子利用,因此研究ricin及RTA的拮抗劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 內(nèi)容、方法:本室通過常規(guī)免疫Balb/c小鼠,獲得了多株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗ricin中和抗體,體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均顯示出一定的中和活性。本文在合理評(píng)價(jià)鼠源抗體功能的基礎(chǔ)上,對(duì)具有高中和活性的鼠源功能抗體進(jìn)行人源化改造獲得嵌合抗體;借助本室建立的“基于抗原—抗體相互作用結(jié)構(gòu)信息設(shè)計(jì)新型結(jié)構(gòu)抗體分子”技術(shù)平臺(tái),利用輕重鏈CDR區(qū)定點(diǎn)突變對(duì)嵌合抗體進(jìn)行體外親和力成熟改造;基于RTA及RTA-底物類似物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),ricin與功能抗體4C13_Fv作用復(fù)合物空間構(gòu)象,利用計(jì)算機(jī)虛擬篩選方法,獲得新型拮抗RTA先導(dǎo)化合物。研究?jī)?nèi)容及方法概括如下: 1、對(duì)具有中和活性的鼠源功能抗體進(jìn)行人源化改造 在鑒定3株小鼠抗ricin單克隆抗體的中和活性的基礎(chǔ)上,選擇中和活性最高的鼠源抗體4C13作為人源化改造的親本抗體,釣取雜交瘤細(xì)胞輕重鏈可變區(qū)基因,構(gòu)建嵌合抗體表達(dá)載體,瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,運(yùn)用ELISA、Western blot及細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)鑒定表達(dá)抗體的抗原識(shí)別特異性、中和活性,并測(cè)定其相對(duì)親和常數(shù); 2、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)提高嵌合抗體C4C13親和力與評(píng)價(jià) 通過計(jì)算機(jī)輔助分子模擬對(duì)抗體4C13可變區(qū)Fv三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理搭建,并通過力學(xué)優(yōu)化獲得其穩(wěn)定的三維構(gòu)象。利用已解析的ricin晶體結(jié)構(gòu),通過分子對(duì)接獲得4C13_Fv片段與ricin相互作用的復(fù)合物模型,經(jīng)計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)、計(jì)算生物學(xué)相關(guān)理論,預(yù)測(cè)抗原抗體相互識(shí)別區(qū)域、關(guān)鍵氨基酸殘基及作用模式;同時(shí)依據(jù)相互作用自由能、分子間氫鍵、疏水作用等,設(shè)計(jì)嵌合抗體C4C13突變體并對(duì)其親和力進(jìn)行理論預(yù)測(cè)。根據(jù)突變體序列設(shè)計(jì)引物,利用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,構(gòu)建相應(yīng)的突變體真核表達(dá)載體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),通過ELISA、Western Blot、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)等手段對(duì)表達(dá)抗體的抗原識(shí)別特異性及親和力大小進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)。 3、基于RTA及RTA-底物類似物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)虛擬篩選小分子拮抗化合物 根據(jù)RTA的晶體結(jié)構(gòu)、RTA與其底物類似物的晶體結(jié)構(gòu)、ricin與4C13_Fv作用復(fù)合物結(jié)構(gòu),結(jié)合RTA突變體實(shí)驗(yàn)結(jié)果,合理確定RTA的脫嘌呤功能區(qū)域。通過計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù),借助距離幾何學(xué)、分子間氫鍵形成理論,利用確定的RTA功能活性區(qū)域結(jié)構(gòu)特征,合理確定藥效團(tuán)特征,進(jìn)而形成與RTA功能域作用位點(diǎn)模式,通過ACD化合物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選。利用分子對(duì)接對(duì)篩選獲得的化合物進(jìn)行理論評(píng)估,確定能夠成為RTA抑制劑的先導(dǎo)化合物。選擇pET32a載體原核表達(dá)RTA,并檢測(cè)其生物學(xué)活性;在分子水平選用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液蛋白合成體系實(shí)驗(yàn)探討化合物抑制RTA的毒性作用;在細(xì)胞水平選擇對(duì)RTA敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞—SP2/0細(xì)胞分析化合物拮抗RTA的生物學(xué)功能,以此評(píng)估篩選先導(dǎo)化合物的活性。 結(jié)果:1、對(duì)具有中和活性的鼠源功能抗體進(jìn)行人源化改造:以小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0建立ricin細(xì)胞毒模型,鑒定并選擇中和活性最高的鼠源抗體4C13作為人源化改造的親本抗體;釣取輕重鏈可變區(qū)基因,構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCMV_4C13_VH和pCMV_4C13_VL,實(shí)現(xiàn)了嵌合抗體在真核細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá),生物學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示,C4C13保持了親本抗體的識(shí)別特異性和中和活性。 2、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)提高嵌合抗體C4C13親和力與評(píng)價(jià):利用分子對(duì)接構(gòu)建穩(wěn)定的4C13_Fv/ricin相互作用的復(fù)合物模型,預(yù)測(cè)抗原—抗體作用模式并確定影響抗體親和力的三個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基,進(jìn)一步設(shè)計(jì)了突變體(M1) VH-N102F,VH-W103Y,(M2)VH-W103Y;(M3) VL-R90G,并對(duì)其親和力進(jìn)行理論預(yù)測(cè);通過ELISA、Western Blot、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)等手段對(duì)表達(dá)抗體的抗原識(shí)別特異性及親和力大小進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè),親和力高低依次為:M1M2C4C13M3,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)測(cè)結(jié)果一致,提示獲得的4C13_Fv/ricin作用復(fù)合物結(jié)構(gòu)是合理的。 3、基于RTA、RTA-底物類似物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)及4C13_Fv/ricin相互作用的復(fù)合物模型虛擬篩選小分子拮抗化合物:通過虛擬篩選ACD化合物數(shù)據(jù)庫(kù)獲得4種小分子化合物,原核表達(dá)的rRTA顯示了良好的生物學(xué)活性,在無細(xì)胞蛋白合成體系實(shí)驗(yàn)中,四個(gè)化合物與陽性對(duì)照都表現(xiàn)出一定的拮抗RTA的活性,細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中,化合物3025對(duì)rRTA顯示出較好的濃度依賴的抑制效應(yīng)。 結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了嵌合抗蓖麻毒素中和抗體C4C13,并保持了親本抗體的識(shí)別特異性和中和活性,其鼠源序列下降了70%,有效降低了在臨床應(yīng)用中可能產(chǎn)生的人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng),提高了治療的有效性;借助“基于抗原—抗體相互作用結(jié)構(gòu)信息設(shè)計(jì)新型結(jié)構(gòu)抗體分子”技術(shù)平臺(tái),成功搭建了ricin與功能抗體4C13 _Fv作用復(fù)合物模型,并對(duì)嵌合抗體進(jìn)行體外親和力成熟改造;利用計(jì)算機(jī)虛擬篩選方法獲得RTA拮抗先導(dǎo)化合物,生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí),獲得的先導(dǎo)化合物能夠阻斷RTA的生物學(xué)功能,為進(jìn)一步研發(fā)RTA小分子拮抗劑奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王景林;蓖麻毒素生物恐怖及其醫(yī)學(xué)防護(hù)[J];科技導(dǎo)報(bào);2003年07期

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本文編號(hào)：1503455