發(fā)布時間：2018-02-01 09:57

  本文關鍵詞： HCC抗原表位 HBc病毒樣顆粒 包涵體 表達與純化 DCs疫苗 HLA-A2轉基因小鼠 腫瘤模型　出處：《河北醫(yī)科大學》2008年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 目的 肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是一種常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率很高,嚴重威脅人類健康。HCC起病隱匿,發(fā)生發(fā)展迅猛,手術切除率和術后生存率均較低,所以一直以來它的臨床療效和預后均不理想。目前在手術、化療、放療之后輔以免疫治療越來越受到醫(yī)學界的重視。但是,腫瘤的低免疫原性和機體對腫瘤的低免疫反應性,使得免疫治療的應用受到限制。目前,樹突狀細胞(dentritic cells,DCs)的免疫呈遞作用在提高機體對腫瘤的免疫反應中得到進一步認識,尤其是DCs細胞在快速誘導CD8+T細胞免疫記憶形成、通過分泌特定細胞因子抑制CD4+CD25+T細胞的功能及誘導針對非優(yōu)勢抗原表位免疫應答等方面占有優(yōu)勢,因而DCs細胞已成為研發(fā)腫瘤疫苗的一個熱點,所以研制一種有效的肝癌DC疫苗來激發(fā)機體的細胞和體液免疫應答以達到控制此類疾病的目的是疫苗學急需解決的問題。 但是隨著對腫瘤免疫治療研究的不斷深入,人們逐漸認識到,腫瘤細胞可通過自身的一些代謝產物使荷瘤宿主體內DCs的數量、表型及其功能發(fā)生異常變化,從而抑制DCs的成熟和抗原遞呈功能,使機體抗腫瘤免疫受到抑制,使腫瘤細胞得以逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用。目前許多研究者應用腫瘤抗原,如腫瘤特異性抗原、腫瘤相關性抗原及完全細胞性抗原體外沖擊致敏DCs,使其避開腫瘤的抑制作用,把經過修飾的DCs疫苗輸回體內,結果可以有效激發(fā)機體產生較強的抗腫瘤免疫應答,但免疫應答一般不能維持。近期的研究表明,這可能是由于抗原負載后的DCs的抗原遞呈能力較弱,或者負載抗原后DCs的壽命降低,因此很難誘導長效的T細胞應答。 病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是不含病毒核酸的空殼結構,許多病毒結構蛋白都具有自動組裝成VLPs的能力。它在形態(tài)結構上與天然的病毒顆粒相似,具有很強的免疫原性和生物學活性。由于VLPs不含有病毒遺傳物質,因此不具有感染性,其中有些已經作為疫苗成功應用于臨床。研究表明,VLPs在沒有任何佐劑的情況下即可誘導較強的細胞與體液免疫應答,并可以通過交叉遞呈的方式將抗原表位遞呈給CD8+T細胞,誘導CTL反應。最重要的是,VLPs在結構上允許外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并將外源性抗原展示在其表面,這個特點就為人們研究疫苗提供了更加廣闊的前景。 黑色素瘤抗原(melanoma antigen, Mage)在正常組織中除睪丸和胎盤組織外均不表達,但在某些惡性腫瘤如肝細胞癌中高度特異表達,其中MAGE1,MAGE3表達最高。甲胎蛋白(AFP)是肝癌細胞分泌性蛋白,也是肝癌的特異性蛋白。本研究選取高表達于HCC的HLA-A2限制的CTL表位MAGE-1第278-286位(KVLEYVIKV)、MAGE-3第271-279位(FLWGPRALV)、AFP第158-166位(FMNKFIYEI)和AFP第542-550位(GVALQTMKL)氨基酸插入至截短的HBcAg(1-144aa)基因羧基端,構建了單表位和多表位嵌合基因至原核表達質粒pET28a中,在大腸桿菌中進行表達、純化,得到顆粒性表達產物HBc-VLPs,負載DCs后作為肝癌的候選疫苗利用HLA-A2轉基因小鼠對此DC疫苗的免疫效果進行了評價,評價其誘導抗原特異的CD8+T細胞應答和抗腫瘤效應,探索其作為兼具預防和治療肝細胞癌作用的新型疫苗的可能性。 方法 1.獲得單表位融合基因 利用巢式PCR技術獲得四種抗原表位肽M1(MAGE-1278-286aa)、M3(MAGE-3271-279aa)、A1 (AFP158-166 aa )和A2 (AFP542-550aa )基因,并通過GA連接子將它們分別插入到截短的HBcAg(1-144aa)基因羧基端,得到單表位融合基因HBc-M1、HBc-M3、HBc -A1和HBc-A2。 2.獲得多表位融合基因 通過PCR的方法得到含有多表位的抗原肽S1(AFP1-Th表位-AFP2)和S2(MAGE1-MAGE3-Th表位)基因,并通過GA連接子將它們分別插入到截短的HBcAg (1-144aa)基因3’末端,得到多表位融合基因HBc-S1和HBc-S2。 3.構建原核表達質粒pET28a-HBc-抗原表位 將上述六種融合基因連入原核表達載體pET28a,然后轉化BL21(DE3)受體菌,經PCR及抽提質粒雙酶切鑒定陽性克隆。抽提陽性克隆的質粒,進行測序。 4. HBc-抗原表位融合蛋白的獲得 構建好的原核表達質粒在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達,并通過改變IPTG濃度、誘導時間及葡萄糖加入量等條件優(yōu)化蛋白表達,目的蛋白主要以包涵體形式存在。蛋白經2M、4M、6M尿素梯度洗滌變性后用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白,經復性透析后得到嵌合病毒樣顆粒蛋白HBc-VLPs,用SDS- PAGE、Western-blot、ELISA和透射電鏡觀察等方法分析鑒定嵌合蛋白分子量大小及其抗原性和顆粒性。 5. HBc-VLPs負載的DCs誘導長效CTL活性及抗腫瘤作用研究。 將制備的HBc-VLPs分別與體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來源的DCs共孵育,做細胞涂片并行細胞免疫熒光化學染色,用激光共聚焦顯微鏡觀察DCs胞漿內攝入的蛋白顆粒;通過混合淋巴細胞反應(MLR)觀察其能否被DCs提呈從而刺激naive T細胞增殖。利用轉基因小鼠荷瘤模型,對HBc-VLPs負載的DC疫苗抑瘤作用及對小鼠抗原特異性淋巴細胞的IFN-γ分泌和CTL活性進行了觀察,并與抗原肽負載的DC疫苗進行了對比。 結果 構建6種HBV嵌合型顆粒蛋白的原核表達載體pET28a-HBc-A1、pET28a-HBc-A2、pET28a-HBc-M1、pET28a- HBc-M3、pET28a-HBc-S1和pET28a-HBc-S2,其中3種目的蛋白HBc-A1、HBc-M1和HBc-M3在大腸桿菌中以包涵體形式獲得表達。經過梯度尿素洗滌,目的蛋白主要溶于6M尿素中,再經Ni-NTA親和層析純化和復性后,蛋白純度達90%以上。經透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)嵌合蛋白HBc-A1、HBc-M1和HBc-M3均具有病毒樣顆粒的結構,Western-blot和ELISA證實嵌合蛋白保留了HBc抗原性。 此外,3種HBc-VLPs分別與體外培養(yǎng)5天的小鼠BMDCs共孵育后,激光共聚焦顯微鏡即可觀察到DCs胞漿內有攝入的蛋白顆粒。進一步通過混合淋巴細胞反應(MLR)還觀察到,VLPs與DCs共培養(yǎng)24h,可以強烈刺激naive T細胞增殖。因此,包涵體變性蛋白經復性可以得到正確折疊的、結構完整的VLPs,且可以被DCs攝取和有效遞呈。在分析HBc-VLPs負載DCs的免疫效果時發(fā)現(xiàn),HBc-VLPs負載的DCs免疫小鼠后第8天,流式細胞儀即可檢測到分泌IFN-γ的CD8+T細胞存在,用LDH法檢測到較強的抗原特異性CTL活性。小鼠荷瘤實驗的結果也說明,給荷瘤B16-pIR-HH 5天的小鼠,用HBc-VLPs負載的DCs免疫后,在腫瘤接種的20天之前均未見到明顯的腫瘤塊,而陰性對照組小鼠的腫瘤生長很快,且小鼠死亡率高(荷瘤存活鼠為1/6),但在荷瘤的20d后,實驗組小鼠的腫瘤開始生長。 結論 1本研究建立了攜帶HCC抗原表位的HBc-VLPs的構建、原核表達、純化的系列技術平臺。 2利用從原核表達系統(tǒng)得到的攜帶HCC抗原表位的HBc-VLPs負載DCs,得到可強烈誘導機體免疫應答和明顯抗腫瘤作用的DCs疫苗。 3利用HLA-A2轉基因小鼠成功制備了可評價HLA-A2限制的CTL表位的小鼠荷瘤模型。 4本研究結果為DCs疫苗的優(yōu)化和評價提供了實驗方法,也為進一步深入研究新型肝細胞癌治療性疫苗的功能和應用奠定了基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 董晨;孟繼鴻;;一種新型戊型肝炎病毒樣顆粒的表達、純化及其免疫原性[J];細胞與分子免疫學雜志;2006年03期

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本文編號：1481583