本文關(guān)鍵詞： 登革病毒 E蛋白 融合多肽 抗原表位 中和　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 在登革病毒編碼的三種結(jié)構(gòu)蛋白中,包膜E蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,位于成熟病毒顆粒表面,構(gòu)成病毒顆粒的突起。E蛋白在空間上形成3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域(I, II和III區(qū)),在病毒吸附、與宿主細(xì)胞膜融合以及病毒組裝過程中具有重要的作用。而且,E蛋白也是病毒的主要抗原,含有多種抗原表位,可通過誘發(fā)中和抗體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答,在機(jī)體抵御登革病毒感染的過程中發(fā)揮重要作用。然而,登革病毒E蛋白,特別是III區(qū)外的構(gòu)象型中和表位的精細(xì)結(jié)構(gòu)尚未完全闡明。其次,不同型和同一型毒株之間在抗體結(jié)合位點(diǎn)上的差異及其對(duì)病毒組織嗜性、復(fù)制效率及致病性等的影響也還有待于進(jìn)一步分析。此外,E蛋白上與登革病毒免疫病理密切相關(guān)的ADE表位也知之甚少。這些問題阻礙了對(duì)登革病毒致病和免疫分子機(jī)理的闡明。因此,確定登革病毒E蛋白中和表位和ADE表位,闡明抗體中和作用的分子機(jī)制,以及進(jìn)一步探討與E蛋白重要生物學(xué)功能相關(guān)的一些關(guān)鍵氨基酸殘基,不僅是了解其分子機(jī)制的第一步,也為登革特異性防治提供重要信息。 本項(xiàng)研究利用登革2型病毒E蛋白特異單抗,分析了病毒E蛋白的中和表位,明確了抗體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)及其中和作用的機(jī)制,并初步探討了重要氨基酸位點(diǎn)突變對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響。研究主要包括四個(gè)部分: 一、登革2型病毒包膜E蛋白特異單克隆抗體的制備 為了制備登革2型病毒E蛋白特異單抗,我們分別以滅活的登革2型病毒和構(gòu)建的病毒全長(zhǎng)prM-E基因的真核重組質(zhì)粒DNA作為免疫原,采用常規(guī)方法建立分泌登革2型病毒E蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞系。最終獲得了10株登革2型病毒特異單抗(2B8、2H11、2D7、2F2、2F10、2A10G6、2B4、2D5、4C10和6B4)。 為了對(duì)這10株單抗所針對(duì)的病毒蛋白進(jìn)行鑒定,我們以穩(wěn)定表達(dá)登革2型病毒prME蛋白的細(xì)胞制備的抗原片對(duì)其進(jìn)行IFA檢測(cè)。結(jié)果證實(shí),這10株雜交瘤細(xì)胞所分泌的單抗均是針對(duì)prM-E抗原的。然后,以大腸桿菌表達(dá)的E蛋白I-II區(qū)或III區(qū)為抗原,采用免疫印跡和ELISA法鑒定單抗所針對(duì)的抗原表位。結(jié)果發(fā)現(xiàn),除2A10G6和2F10結(jié)合E蛋白I-II區(qū)外,其余單抗均針對(duì)E蛋白III區(qū)。此外,對(duì)這些單抗的交叉反應(yīng)活性測(cè)定結(jié)果顯示,2B8、2H11、2D7和2F2是登革2型病毒特異的,而其余6株均具有黃病毒交叉反應(yīng)活性。上述結(jié)果表明,我們獲得了針對(duì)登革2型病毒E蛋白不同的結(jié)構(gòu)域、對(duì)黃病毒屬成員具有不同反應(yīng)性的單抗,為E蛋白抗原表位分析、登革新的診斷試劑以及新型疫苗和抗病毒藥物研究提供重要工具。 二、登革2型病毒E蛋白特異單克隆抗體的中和作用機(jī)制 我們采用蝕斑中和減少試驗(yàn)和乳鼠保護(hù)試驗(yàn)觀察這10株登革2型病毒E蛋白特異單抗的中和活性和保護(hù)作用。結(jié)果顯示,三株單抗(2B8、2A10G6和2F10)對(duì)登革2型病毒具有較強(qiáng)的中和活性和免疫保護(hù)作用。其中E蛋白I-II區(qū)特異單抗2A10G6強(qiáng)于III區(qū)特異單抗2B8,該抗體可在登革病毒感染4h和24h后分別使66.7%和40%的小鼠存活。此外,單抗2A10G6還有效中和登革1、3和4型、黃熱和西尼羅病毒,與目前已知的黃病毒交叉中和抗體比較,具有更加廣譜的黃病毒交叉中和活性。 為了確定登革病毒E蛋白特異抗體中和作用的機(jī)制,我們采用定量RT-PCR法和蝕斑法測(cè)定單抗(2B8和2A10G6)是在病毒增殖周期中的哪一個(gè)階段抑制病毒的感染。結(jié)果顯示,2B8主要抑制登革病毒增殖周期中的吸附階段,抑制倍數(shù)達(dá)3.1;而2A10G6可在病毒吸附后的病毒E蛋白與宿主細(xì)胞膜融合階段發(fā)揮其中和作用。上述結(jié)果說明,這2株中和抗體可通過結(jié)合其不同的中和表位在病毒增殖周期的初期階段抑制登革病毒的感染。另一方面,我們?cè)谌藛魏思?xì)胞K562上觀察了亞中和濃度的單抗2A10G6是否可增強(qiáng)登革1-4型病毒對(duì)表達(dá)Fcγ受體的單核細(xì)胞的感染。結(jié)果發(fā)現(xiàn),亞中和濃度的單抗2A10G6可增強(qiáng)4個(gè)型登革病毒對(duì)單核細(xì)胞的感染,增加倍數(shù)達(dá)5-10倍,表明該中和抗體具有感染增強(qiáng)活性。 三、登革2型病毒E蛋白中和表位的篩選與鑒定 為了分析登革病毒E蛋白中和表位,我們首先采用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)對(duì)單抗2A10G6結(jié)合的多肽進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示,該單抗所對(duì)應(yīng)的多肽序列位于登革2型病毒E蛋白融合多肽的98DRXW101區(qū)域。采用ELISA法進(jìn)一步證實(shí)了相應(yīng)的合成多肽可與單抗2A10G6特異結(jié)合。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),該多肽序列在所有黃病毒的E蛋白氨基酸序列中是高度保守的。根據(jù)E蛋白晶體結(jié)構(gòu),我們發(fā)現(xiàn)由D98、R99和W101位氨基酸殘基可構(gòu)成一個(gè)2A10G6結(jié)合的構(gòu)象型表位,該表位暴露在登革2型病毒E蛋白II區(qū)頂端融合多肽的表面,且其空間構(gòu)象在不同黃病毒E蛋白結(jié)構(gòu)中是較為保守的。 為了確定單抗2A10G6與E蛋白結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn),我們利用免疫印跡觀察D98、R99和W101位突變對(duì)抗體結(jié)合活性的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)D98R和R99G單獨(dú)突變時(shí),2A10G6與E蛋白的結(jié)合不受影響;當(dāng)W101R突變時(shí),2A10G6幾乎不能與E蛋白結(jié)合。當(dāng)這些氨基酸位點(diǎn)組合突變時(shí),2A10G6結(jié)合活性基本上喪失。表明登革病毒E蛋白融合多肽內(nèi)的W101位可能是2A10G6與其結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn),而D98和R99位氨基酸對(duì)抗體結(jié)合也可產(chǎn)生一定的影響。 此外,我們通過抗體壓力篩選和蝕斑純化,獲得了1株可逃逸單抗2A10G6中和的突變株。序列測(cè)定發(fā)現(xiàn),該突變株在登革2型病毒E蛋白第126位處氨基酸發(fā)生了突變(Glu→Lys),表明登革2型病毒E蛋白126位氨基酸是單抗2A10G6特異識(shí)別的氨基酸位點(diǎn),該位點(diǎn)可與D98、R99和W101位共同形成2A10G6表位。同時(shí),這株逃逸株具有與親本株相似的病毒復(fù)制效率,但乳鼠神經(jīng)毒力明顯降低,表明E蛋白126位氨基酸是登革2型病毒的毒力相關(guān)位點(diǎn)。 四、登革2型病毒E蛋白特異嵌合抗體的構(gòu)建及其生物學(xué)特性 為了探討抗體Fc區(qū)介導(dǎo)的效應(yīng)器功能以及為下一步構(gòu)建人源化抗體提供理論依據(jù),我們首先用5’RACE法測(cè)定并預(yù)測(cè)了鼠源抗體2A10G6的輕重鏈可變區(qū)序列中可能的互補(bǔ)決定區(qū)(Complementarity-determining region,CDR)和框架區(qū)(Framework region,FR)。結(jié)果顯示,重鏈可變區(qū)的3個(gè)CDR區(qū)氨基酸序列依次為EYTMH、GIDPNNGGTNYNQKFKG和RDYYALDY;輕鏈可變區(qū)的3個(gè)CDR區(qū)氨基酸序列依次為KASQHVGSAVA、SASNRYT和QQYNSYPT。在此基礎(chǔ)上,我們分別構(gòu)建了嵌合抗體輕重鏈的真核表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,經(jīng)G418壓力篩選獲得可穩(wěn)定分泌登革病毒E蛋白特異嵌合抗體的細(xì)胞株,且該抗體具有與親本鼠源抗體相似的抗原結(jié)合和中和活性。 本研究為分析E蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、闡明登革病毒致病和免疫的分子機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ),也為研制新型疫苗和抗病毒藥物提供了重要信息。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1465900