發(fā)布時間：2018-01-20 17:07

  本文關鍵詞： Nkx2-5 同源盒轉錄因子 pEGFP-N1-Nkx2-5 P19細胞 心肌分化 基因轉染 5-氮胞苷　出處：《河北醫(yī)科大學》2008年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 目的:哺乳動物成熟個體中的心肌細胞是終末分化的細胞,受到損傷時一般由瘢痕進行替代修復,由此造成的心肌細胞缺失和數(shù)量下降是導致心臟收縮功能下降,進而引起心力衰竭等心臟疾病的重要原因。近年來的研究表明,成體心臟中的心肌干細胞數(shù)量極少,不能對受損的心肌起到修復作用,加上心臟移植療法的供體、免疫原性和費用的限制,現(xiàn)在眾多研究者把目光投向細胞移植治療取代壞死的心肌細胞、增加有功能的心肌細胞數(shù)量。動物實驗也證實移植的骨髓間充質(zhì)干細胞、新生心肌細胞甚至骨骼肌細胞都可以在一定程度上改善心功能,但是細胞移植的研究還有很多亟待解決的難題,首要難題之一就是上述用于移植的細胞向心肌細胞的轉化效率太低,得不到移植所需的大量有收縮功能的心肌細胞。因此探索在心肌分化過程中的具體機制將具有重要意義,許多研究者推測心肌分化的過程始于某個或某些關鍵基因的啟動,通常這些基因的蛋白產(chǎn)物都是轉錄因子,它們可以使下游的靶基因呈級聯(lián)式地激活,直至分化完成。 同源盒基因Nkx2-5又稱為心臟特異性同源盒基因(cardiac specific homeobox, Csx),是所有脊椎動物心臟發(fā)生中最早表達的轉錄因子之一,也是目前研究最多的與心臟發(fā)育和心肌分化密切相關的轉錄因子之一,與早期研究發(fā)現(xiàn)的、決定果蠅心臟發(fā)育的tinman基因為同源基因,Nkx2-5屬于NK2型同源盒基因家族成員。該基因在復雜的心臟發(fā)育程序中起重要調(diào)控作用,許多研究表明Nkx2-5的表達對于胚胎心肌細胞的形成極為重要。在非洲蟾蜍胚胎,過表達Nkx2-5可以導致由心肌數(shù)目增多引起的心臟增大。注射Nkx2-5到斑馬魚的胚胎導致心肌數(shù)目增多,心臟增大,將表達Nkx2-5的細胞移植至生心區(qū)以外的組織可引發(fā)心臟標志物的轉錄和表達。國外也有報道Nkx2-5的表達可促進P19細胞和P19CL6細胞向心肌細胞分化,提高心特異基因的表達,且保護心肌免受脅迫引起的損害。研究證實,Nkx2-5基因調(diào)控心納素、心臟α-actin,心錨蛋白重復序列蛋白、A1腺甙受體、鈣網(wǎng)織蛋白、間隙連接蛋白40等基因的表達。這些目的基因編碼重要的結構蛋白轉錄調(diào)控心肌特性,說明Nkx2-5有轉錄調(diào)控心肌程序的功能。但Nkx2-5的表達能否使哺乳類干細胞產(chǎn)生有收縮功能的心肌細胞以及使非心肌細胞分化為心肌細胞仍有不同爭議。而且國內(nèi)關于Nkx2-5在心肌分化中作用的相關報道少而又少,因此本研究擬做該方面的研究。 P19胚胎癌細胞(embryonal carcinoma cells, EC)是從C3H/He雄性小鼠畸胎瘤中誘導形成的EC細胞系,體外培養(yǎng)經(jīng)多次傳代仍保持胚胎干細胞的特性。P19細胞經(jīng)誘導可分化為包括心肌在內(nèi)的多種細胞,在P19細胞向心肌分化的過程中,其細胞發(fā)育相關基因的表達及電生理特性與正常小鼠心肌發(fā)育過程相似,且該細胞易于進行基因操作,是研究心肌細胞發(fā)育的良好體外模型。 因此,本課題擬將Nkx2-5基因轉染P19細胞,并篩選出穩(wěn)定表達Nkx2-5的P19細胞,觀察其在沒有誘導劑的情況下向心肌分化的情況。并研究在5-氮胞苷(5-azacytidine, 5-aza)的作用下,穩(wěn)定表達Nkx2-5的P19細胞在單層培養(yǎng)時向心肌分化的情況,以闡明心肌細胞分化過程中的一些規(guī)律,為各種干細胞有效轉化為心肌細胞提供策略。 方法: 1 pEGFP-N1-Nkx2-5真核表達質(zhì)粒的構建、鑒定由日本Hiroshi Akazawa博士惠贈的pEFSA-HA-Nkx2-5質(zhì)粒,經(jīng)常規(guī)CaCl2法轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,擴增提取之后經(jīng)XbaI,HindⅢ雙酶切鑒定。以pEFSA-HA-Nkx質(zhì)粒為模板,PCR擴增Nkx2-5基因全長,瓊脂糖凝膠電泳,割膠回收靶片斷。再以擴增的Nkx2-5基因全長為模板,PCR擴增Nkx2-5基因編碼框,瓊脂糖凝膠電泳,割膠回收靶片斷。PCR擴增的Nkx2-5基因編碼框和載體pEGFP-N1分別經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切過夜,分別回收后將二者連接,置16℃恒溫過夜。連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,涂布于含卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上,37℃倒置培養(yǎng)16～24 h;挑取單個陽性菌落,提取重組質(zhì)粒,進行菌落PCR鑒定有無目的片段,再經(jīng)BamHI、XhoI雙酶切鑒定,同時將構建質(zhì)粒送上海生工生物工程技術公司測序。 2外源表達Nkx2-5誘導聚集P19細胞向心肌分化 實驗分轉染組和未轉染組。轉染組轉染之前通過預實驗確定合適的細胞接種密度,轉染最佳體系,G418篩選濃度。本實驗采用陽離子轉染試劑Lipofectamine2000將質(zhì)粒pEGFP-N1-Nkx2-5轉染P19細胞,轉染之后24h將細胞1:10比例傳代,G418穩(wěn)定篩選兩周后,將篩出細胞聚集培養(yǎng)四天形成聚集體,聚集體移入培養(yǎng)皿中貼壁生長。在貼壁的4天、8天、12天、16天取細胞,免疫細胞化學檢測desmin、α-sarcomeric actin和cTnT的表達;免疫熒光雙標檢測α-sarcomeric actin和cTnT的共表達;RT-PCR檢測GATA-4、α-MHC、ANP基因的表達;Western blot檢測α-sarcomeric actin和cTnT蛋白的表達。并取貼壁16天的細胞透射電鏡觀察超微結構的變化。未轉染組將P19細胞直接聚集培養(yǎng),觀察分化的情況,未轉染組檢測指標和取材時間同轉染組。 3 5-氮胞苷誘導外源表達Nkx2-5的P19細胞單層培養(yǎng)時向心肌分化 實驗分為實驗組和對照組,實驗組為5-aza誘導的穩(wěn)定表達Nkx2-5基因的單層培養(yǎng)P19細胞,對照組為5-aza誘導的單層培養(yǎng)P19細胞。用1μmol/L的5-aza濃度分別對實驗組和對照組的細胞進行誘導。在誘導的4天、8天、12天、16天取細胞,免疫細胞化學檢測α-sarcomeric actin和cTnT的表達;免疫熒光雙標檢測α-sarcomeric actin和cTnT的共表達;RT-PCR檢測GATA-4、α-MHC和ANP基因的表達;Western blot檢測α-sarcomeric actin和cTnT的蛋白表達;并取實驗組誘導16天的細胞透射電鏡觀察超微結構變化。 結果: 1 pEGFP-N1-Nkx2-5真核表達質(zhì)粒的構建、鑒定 pEFSA-HA-Nkx2-5質(zhì)粒經(jīng)XbaI,HindⅢ雙酶切鑒定含有約1500bp的基因片段,與人Nkx2-5基因全長(1585bp)大小一致,所以pEFSA-HA-Nkx2-5質(zhì)粒確含有人Nkx2-5基因全長。以pEFSA-HA-Nkx2-5質(zhì)粒為模板,第一次擴增出約1500bp的基因片段,與人Nkx2-5基因全長大小一致;以基因全長為模板,第二次擴增出約1000bp的基因片段,與人Nkx2-5基因編碼框(974bp)大小一致。酶切Nkx2-5基因的編碼框及克隆用載體pEGFP-N1分別得到帶有BamH I和Xho I酶切位點的基因片段(約900bp)和載體(4.7kb),分別回收連接。連接產(chǎn)物轉化后,篩出新生菌落PCR顯示可以擴增出大小約1000bp的目的條帶,抽提重組質(zhì)粒,經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切之后,可獲得約1000bp和4.7kb的條帶。用啟動子CMV引物測序,測序結果經(jīng)與Gene Bank查詢的人Nkx2-5基因編碼框比對,98%一致。且基因起始端Kozak序列完全,基因終止子已經(jīng)突變、讀碼框正確。確定在本研究中,pEGFP-N1-Nkx2-5重組質(zhì)粒構建成功。 2外源表達Nkx2-5誘導聚集P19細胞向心肌分化 實驗確定,轉染細胞傳代密度:2×105/ml;轉染的最佳體系:采用質(zhì)粒DNA(μg)和轉染試劑Lipofectamine2000(μl) 1:3的比率;G418穩(wěn)定篩選濃度:700μg/ml。轉染組在轉染質(zhì)粒pEGFP-N1-Nkx2-5之后的24h可見部分P19細胞表達Nkx2-5-EGFP融合蛋白,700μg/ml G418篩選14天后,大多數(shù)細胞具有綠色熒光,這些細胞為外源表達Nkx2-5的P19細胞。轉染組和未轉染組的細胞聚集培養(yǎng)4天形成聚集體,聚集體貼壁培養(yǎng)后細胞由周邊爬出形成生長暈,暈中細胞胞體變大變長,伸出突起、彼此相連。在轉染組,免疫細胞化學結果顯示:Desmin、α-sarcomeric actin和cTnT三種抗體4天的時候都沒有表達,8天、12天、16天時三種抗體均有表達,呈逐漸增高的趨勢。12天、16天的細胞中有明顯棕黃色成束樣結構。Desmin在16天、12天的表達量與8天比有顯著差異(P0.01);α-sarcomeric actin在16天的表達量與8天比有顯著差異(P0.01);cTnT的表達16天與8天比有顯著差異(P0.01)。免疫熒光雙標結果顯示α-sarcomeric actin和cTnT兩種抗體在貼壁培養(yǎng)的8天、12天、16天時共表達,且表達量呈逐漸增高趨勢,兩種蛋白在同一細胞相同部位重疊表達。RT-PCR分析結果顯示:轉染組GATA-4在貼壁培養(yǎng)的4天有表達,8天、12天表達逐漸增多,16天時表達有所下降。α-MHC和ANP在貼壁培養(yǎng)的8天有表達,12天和16天時表達逐漸增多。統(tǒng)計結果表明GATA-4表達量8天、12天、16天與4天比有顯著差異(P0.05或P0.01),α-MHC在12天、16天的表達量與8天比有顯著差異(P0.05,P0.01),ANP在16天的表達量與8天比有顯著差異(P0.01),16天表達量與12天比也有顯著差異(P0.01);Western Blot結果顯示:兩種蛋白都是在8天的時候有表達,12天和16天時表達量逐漸增高,統(tǒng)計結果顯示12天、16天時α-sarcomeric actin的表達量與8天相比有顯著差異(P0.01),16天的表達量與12天相比也有顯著差異(P0.01)。cTnT 12天、16天的表達量與8天相比有顯著差異(P0.01),16天的表達量與12天相比,也有顯著差異(P0.01)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)轉染組的細胞經(jīng)聚集、貼壁培養(yǎng)16天后,部分細胞胞體呈長柱形,相鄰細胞間互相連接在一起,而且出現(xiàn)特化的細胞連接結構,連接的兩側胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)微絲樣結構。部分細胞的胞質(zhì)中,出現(xiàn)密集平行排列的肌絲樣結構,但未見到肌節(jié)樣結構。培養(yǎng)過程中轉染組細胞沒有出現(xiàn)心肌樣跳動。未轉染組免疫細胞化學、免疫熒光雙標、RT-PCR和Western Blot結果均呈陰性,電鏡觀察未見分化的細胞。 3 5-氮胞苷誘導外源表達Nkx2-5的P19細胞單層培養(yǎng)時向心肌分化 在5-aza誘導時,實驗組和對照組的細胞較未加誘導劑的P19細胞生長緩慢,每日有多個細胞死亡、變圓漂浮。隨著細胞數(shù)目增多,聚集成類似于聚集體貼壁生長的狀態(tài),中心細胞小、密集,周邊細胞爬出,呈放射狀排列,胞體變長呈梭形,并伸出突起。細胞形成聚集生長之后,死亡細胞變少。兩組在培養(yǎng)過程中都沒有發(fā)現(xiàn)細胞跳動現(xiàn)象。實驗組在5-aza誘導后8天兩種抗體有陽性表達,12天、16天的表達量逐漸增多,細胞中棕黃色成束絲樣結構增多。統(tǒng)計結果顯示:α-sarcomeric actin的表達,16天與8天比有顯著差異(P0.01),16天與12天比也有顯著差異(P0.01)。cTnT的表達16天與8天比有顯著差異(P0.01)。對照組細胞在5-aza誘導的4、8、12、16天均沒有檢測到α-sarcomeric actin和cTnT的陽性表達。免疫熒光雙標結果顯示:在實驗組,α-sarcomeric actin和cTnT兩種抗體在5-aza誘導的第8天、12天、16天時有表達,且表達量呈逐漸增高的趨勢,兩種蛋白在同一細胞相同部位重疊表達。對照組沒有兩種蛋白的共表達。RT-PCR結果顯示:實驗組GATA-4在誘導的4天有表達,8天、12天、16天表達逐漸增多。α-MHC和ANP在5-aza誘導后的8天有表達,12天和16天表達逐漸增多;統(tǒng)計結果表明:GATA-4表達量12天、16天與4天比有顯著差異(P0.01),16天與8天比有顯著差異(P0.01),16天與12天比也有顯著差異(P0.05)。α-MHC在16天、12天的表達量與8天比有顯著差異(P0.01),16天的表達量與12天比有顯著差異(P0.01)。ANP在16天、12天的表達量與8天比增高,有顯著差異(P0.01),16天表達量與12天比增高,有顯著差異(P0.05)。在對照組,ANP沒有表達;GATA-4在8天、12天、16天有表達,表達量逐漸增高,4天時沒有表達。α-MHC在12天、16天時有表達。統(tǒng)計結果顯示:GATA-4的表達只有16天與8天比有顯著差異(P0.05)。α-MHC在12天、16天時的表達沒有顯著差異。RT-PCR結果在兩組之間有差異,實驗組細胞GATA-4、α-MHC表達提前,且在各個時間點,實驗組細胞兩個基因的表達量與對照組相比均增高,除了α-MHC在12天的表達兩組間沒有顯著差異,其他時間點都有顯著差異(P0.01或P0.05);對照組ANP沒有表達,而在實驗組ANP有表達。Western Blot結果顯示:實驗組細胞α-sarcomeric actin和cTnT在8天、12天和16天時有表達,且表達逐漸增高;在實驗組,16天、12天時α-sarcomeric actin的表達與8天比有顯著差異(P0.01),16天與12天比也有顯著差異(P0.05)。16天、12天時cTnT的表達與8天比有顯著差異(P0.01);對照組兩種蛋白沒有表達。實驗組電鏡觀察發(fā)現(xiàn)部分細胞相鄰處分化出細胞連接,連接的兩側胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)微絲樣結構。有些相鄰細胞間伸出相互嵌合的突起并分化出幼稚的細胞連接,類似心肌閏盤的早期結構。部分細胞的胞質(zhì)中,可見密集平行排列肌絲樣結構,肌絲樣結構上有電子密度高的區(qū)域,類似于幼稚的明暗帶結構或平滑肌的密斑密體結構。 結論: 1成功擴增出人Nkx2-5基因編碼框;成功構建真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1-Nkx2-5,為以后研究Nkx2-5基因在心肌分化和心臟發(fā)育中的作用奠定了基礎。 2真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1-Nkx2-5可在P19細胞中表達,可以用于真核細胞的轉染和穩(wěn)定篩選。 3外源表達Nkx2-5基因的P19細胞不需誘導劑,只聚集培養(yǎng)即可向心肌細胞分化,誘導心肌標志物和橫紋肌標志物的表達,且表達量隨培養(yǎng)天數(shù)增加而逐漸增高。外源表達Nkx2-5基因可誘導P19細胞向心肌分化。 4 5-aza誘導使單層培養(yǎng)的P19細胞向心肌分化,表達心肌早期轉錄因子和心肌特異基因,但是沒有蛋白產(chǎn)物的表達。 5 5-aza誘導使單層培養(yǎng)的外源表達Nkx2-5基因的P19細胞向心肌分化,在基因水平和蛋白水平表達心肌標志物和橫紋肌標志物,且表達量隨培養(yǎng)天數(shù)增加而逐漸增高。 6在5-aza誘導單層培養(yǎng)時,外源表達Nkx2-5基因的P19細胞向心肌分化的情況優(yōu)于未轉染的P19細胞。說明Nkx2-5基因可以促進P19細胞單層培養(yǎng)時向心肌細胞的分化。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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1 張金平;外源表達Nkx2-5基因誘導P19細胞心肌分化[D];河北醫(yī)科大學;2008年

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本文編號：1448998