發(fā)布時(shí)間：2018-01-18 04:36

  本文關(guān)鍵詞：蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)核DNA疫苗的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《武漢大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：結(jié)核病(tuberculosis, TB)是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病,近年來世界范圍內(nèi)不少地區(qū)結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率再度增高。BCG雖然一直被廣泛應(yīng)用于預(yù)防結(jié)核病,但其保護(hù)效果并不穩(wěn)定,對(duì)成人肺結(jié)核的保護(hù)效應(yīng)十分有限,而且BCG自身還有著一些難以克服的應(yīng)用局限性。因此,發(fā)展安全、高效的新型結(jié)核疫苗已成當(dāng)務(wù)之急。 在眾多新型抗結(jié)核疫苗的研究中,DNA疫苗以其眾多的突出優(yōu)點(diǎn)成為國(guó)內(nèi)外結(jié)核疫苗研究的熱點(diǎn)之一。自1994年Silva等人率先開展抗結(jié)核DNA疫苗的研究以來,迄今已有數(shù)十種抗結(jié)核DNA疫苗在臨床前動(dòng)物模型試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的效應(yīng)。遺憾的是,雖然這些疫苗在小動(dòng)物模型中表現(xiàn)良好,但其在大動(dòng)物和高等靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的表現(xiàn)卻常常達(dá)不到預(yù)期水平。然而,新近四種獸用DNA疫苗的獲準(zhǔn)面世和DNA疫苗在腫瘤、艾滋病和瘧疾等疾病的臨床試驗(yàn)中的良好表現(xiàn)再次證明了DNA疫苗在疾病預(yù)防和免疫治療中的應(yīng)用前景。因此增強(qiáng)結(jié)核DNA疫苗的免疫效應(yīng)成為當(dāng)前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。 在眾多強(qiáng)化DNA疫苗的措施中,蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)(protein transduction)技術(shù)的應(yīng)用是一項(xiàng)較為新穎和較有希望的方式之一。研究表明,來源于幾種α-皰疹病毒,如單純皰疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus, HSV-1)、牛皰疹病毒Ⅰ型(bovine herpes virus, BHV-1)、馬立克氏病病毒Ⅰ型(MDV-1)和偽狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)的間質(zhì)蛋白VP22具有高效的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能和在細(xì)胞間自主傳遞的能力,這種現(xiàn)象被稱為“蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)”。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)這些具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的VP22分子還能夠有效地?cái)y帶異源蛋白質(zhì)、多肽和核酸等多種物質(zhì)進(jìn)入各種細(xì)胞,并介導(dǎo)上述物質(zhì)從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞向鄰近的細(xì)胞間傳遞,同時(shí)保留與之共轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的生物學(xué)活性和功能。不僅如此,許多研究證實(shí),這些VP22分子還具有明顯的免疫佐劑功能,能夠顯著增強(qiáng)常規(guī)DNA疫苗、“自主復(fù)制型”RNA疫苗、“自殺性”DNA疫苗、重組病毒載體疫苗的免疫效應(yīng)以及重組DNA疫苗和重組腺病毒疫苗介導(dǎo)的基因治療效果。其中,牛皰疹病毒Ⅰ型VP22(BVP22)是迄今發(fā)現(xiàn)的具有最強(qiáng)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的天然分子,在疫苗和基因治療的研究中具有很高的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用潛力。BVP22是否也具有增強(qiáng)結(jié)核DNA疫苗的免疫效應(yīng)的能力?這方面的研究尚未見報(bào)道,對(duì)該問題的研究不僅可以拓寬蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)的應(yīng)用范圍,而且還有望為提高結(jié)核DNA疫苗的免疫效應(yīng)和保護(hù)效應(yīng)提供新思路。 抗原85B(Ag85B)是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染過程中的重要免疫保護(hù)性抗原之一,廣泛應(yīng)用于結(jié)核新疫苗的研究中。研究表明,無(wú)論是編碼Mtb單一Ag85B的質(zhì)粒或是Ag85B與Mtb其它保護(hù)性抗原多基因融合表達(dá)的質(zhì)粒免疫小鼠／豚鼠,都可以誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答,并顯著減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脾肺臟器中的荷菌數(shù),延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存時(shí)間。不僅如此,研究發(fā)現(xiàn)編碼MtbAg85B的DNA疫苗還具有較好的免疫治療效應(yīng)。鑒于上述研究背景,我們選擇了Mtb的Ag85B基因和具有最強(qiáng)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)的牛皰疹病毒Ⅰ型的VP22(BVP22)基因作為本研究的目的基因,構(gòu)建了BVP22基因與MtbAg85B基因融合表達(dá)的DNA疫苗,并觀察了該疫苗在C57BL/6小鼠中所誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)和對(duì)結(jié)核桿菌H37Rv毒株感染的保護(hù)效應(yīng),對(duì)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)分子BVP22應(yīng)用于增強(qiáng)結(jié)核DNA疫苗效應(yīng)的可能性作出評(píng)價(jià)。 本實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)部分： 第一部分結(jié)核桿菌Ag85B與牛皰疹病毒Ⅰ型VP22(BVP22)融合基因疫苗的構(gòu)建及其免疫學(xué)特性研究 目的：構(gòu)建編碼結(jié)核桿菌Ag85B的DNA疫苗和Ag85B基因與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)分子BVP22基因融合表達(dá)的DNA疫苗,并對(duì)兩種疫苗的免疫學(xué)特性進(jìn)行比較研究。 方法：1、用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcAg85B, pcBVP22, pcBVP22-Ag85B和表達(dá)Ag85B的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-Ag85B。經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切反應(yīng)及序列測(cè)定證實(shí)構(gòu)建正確后,將純化的真核表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,用RT-PCR和Western blott檢測(cè)重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)。2、大量制備純化的真核表達(dá)質(zhì)粒pcAg85B、pcBVP22-Ag85B、pcBVP22和空白載體pcDNA3.1(+),肌肉注射免疫雌性C57BL/6小鼠,連續(xù)3次,每次間隔2周。設(shè)置相應(yīng)陰性對(duì)照PBS對(duì)照組,空載對(duì)照組和pcBVP22對(duì)照組以及陽(yáng)性對(duì)照BCG組。于末次免疫后六周剖殺小鼠,間接ELISA法檢測(cè)血清中Ag85B特異性的抗體水平；MTT法檢測(cè)脾臟中的淋巴細(xì)胞特異性增殖能力；ELISPOT檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ和IL-4的T細(xì)胞數(shù)量,以期對(duì)兩種質(zhì)粒的免疫效果作出比較。 結(jié)果：1、經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶酶切反應(yīng)及DNA雙向測(cè)序證實(shí),pcAg85B和pcBVP22-Ag85B融合表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)證實(shí),兩種質(zhì)粒都能夠在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)相應(yīng)的mRNA及蛋白質(zhì)；2、肌注免疫C57BL/6小鼠后,質(zhì)粒pcAg85B和pcBVP22-Ag85B均能在小鼠體內(nèi)有效地誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,均可使小鼠體內(nèi)的抗原特異性抗體滴度和抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖能力顯著高于PBS對(duì)照組、空載對(duì)照組和pcBVP22對(duì)照組水平(P0.05)；pcAg85B和pcBVP22-Ag85B二組之間的差異也具有顯著性(P0.05),后者雖略低于BCG組水平,但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)顯著性(P0.05)；ELISPOT檢測(cè)結(jié)果顯示,在pcAg85B和pcBVP22-Ag85B免疫組小鼠的脾臟中分泌IFN-y的淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著多于PBS對(duì)照組、空載對(duì)照組和pcBVP22對(duì)照組(P0.05)；pcBVP22-Ag85B免疫組IFN-y的分泌細(xì)胞的數(shù)量明顯多于pcAg85B免疫組,略低于BCG組,但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析二組之間無(wú)顯著性差異(P0.05)。在兩種質(zhì)粒和BCG免疫的小鼠的脾臟中檢測(cè)到的IL-4生成細(xì)胞的數(shù)量與PBS對(duì)照組、空載對(duì)照組和pcBVP22對(duì)照組相比,差異無(wú)顯著性(P0.05)。 結(jié)論：pcAg85B和pcBVP22-Ag85B兩種質(zhì)粒在C57BL/6小鼠體內(nèi)均可誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答,且融合表達(dá)的pcBVP22-Ag85B質(zhì)粒所誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)均高于單表達(dá)結(jié)核抗原的pcAg85B。我們推測(cè)這種現(xiàn)象可能與BVP22分子的細(xì)胞間傳遞功能有關(guān),BVP22有可能通過攜帶Ag85B在多種細(xì)胞內(nèi)外“穿梭”,提高了抗原分子在體內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞的能力和抗原呈遞的作用,從而增強(qiáng)Ag85BDNA疫苗的免疫原性,其詳細(xì)機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。 第二部分結(jié)核桿菌Ag85B與牛皰疹病毒Ⅰ型VP22(BVP22)融合基因疫苗對(duì)結(jié)核桿菌感染的保護(hù)效應(yīng)研究 目的：建立小鼠結(jié)核病模型,探討重組質(zhì)粒pcAg85B和pcBVP22-Ag85B對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體的保護(hù)效應(yīng)。 方法：按第一部分所述方法免疫C57BL/6小鼠�；蛎庖呓Y(jié)束6周后,每組隨機(jī)挑選12只小鼠在ABSL-3 (Animal Biosafety Level-3 Laboratory)實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)尾靜脈感染結(jié)核分枝桿菌H37Rv(感染劑量：8×106CFU/只)。攻毒后觀察各實(shí)驗(yàn)組小鼠一般生存狀態(tài)、死亡發(fā)生時(shí)間以及小鼠半數(shù)死亡時(shí)間(T5o),于感染后35天解剖小鼠(含35天以內(nèi)死亡凍存的小鼠)。取小鼠的脾及部分肺組織,用來做臟器組織中結(jié)核桿菌的荷菌量的觀察；另一部分肺組織用來觀察各組之間的組織病理學(xué)改變,切片做HE染色和抗酸染色檢查；同時(shí)從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各取2只存活小鼠以及2只正常未感染小鼠,取脾分離淋巴細(xì)胞,經(jīng)FITC和PE標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾臟中CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率。通過上述指標(biāo)的觀察,對(duì)pcAg85B和pcBVP22-Ag85B的抗感染保護(hù)效應(yīng)作出評(píng)價(jià)。 結(jié)果：攻毒后頭2周,各實(shí)驗(yàn)組小鼠在進(jìn)食、飲水以及體重方面無(wú)明顯差異,自攻毒后第三周始,PBS對(duì)照組、空載對(duì)照組和pcBVP22對(duì)照組小鼠開始出現(xiàn)進(jìn)食減少,精神萎靡,體重減輕等現(xiàn)象,并分別于靜脈攻毒后第17天、19天和18天開始出現(xiàn)死亡,而質(zhì)粒pcAg85B和pcBVP22-Ag85B免疫組小鼠分別于攻毒后第24和30天開始出現(xiàn)死亡。至感染后第35天時(shí),陰性對(duì)照PBS組小鼠存活2只,空載對(duì)照組存活2只,pcBVP22組存活3只,pcAg85B免疫組小鼠存活5只,pcBVP22-Ag85B免疫組小鼠存活9只,BCG免疫組小鼠全部存活。pcAg85B和pcBVP22-Ag85B兩種質(zhì)粒免疫組小鼠的半數(shù)死亡時(shí)間均超過PBS對(duì)照組、空載對(duì)照組和pcBVP22對(duì)照組一周以上,pcBVP22-Ag85B組小鼠的半數(shù)死亡時(shí)間又超過pcAg85B免疫組一周以上。小鼠脾、肺組織中細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：pcAg85B免疫組小鼠脾、肺組織中細(xì)菌計(jì)數(shù)(1og10CFU)分別為5.3328±0.1031和5.3174±0.0276,pcBVP22-Ag85B免疫組小鼠脾、肺組織中的細(xì)菌計(jì)數(shù)分別為5.0031±0.0774和4.9313±0.0592,顯著低于PBS對(duì)照組、空載對(duì)照組和pcBVP22對(duì)照組(分別為6.0065±0.0482、5.9443±0.0345；6.0039士0.0191、5.9362±0.0192；5.9794±0.0559、5.9416±0.0312,P0.05)。其中,pcBVP22-Ag85B免疫組小鼠脾、肺組織中的細(xì)菌計(jì)數(shù)雖略高于BCG免疫組小鼠的相應(yīng)組織中的細(xì)菌計(jì)數(shù)(4.8669±0.1252、4.7813士0.1129),但差異無(wú)顯著性(P0.05)。各實(shí)驗(yàn)組肺組織HE染色結(jié)果顯示：PBS對(duì)照組、空載對(duì)照組和pcBVP22對(duì)照組小鼠的肺組織出現(xiàn)廣泛性充血、滲出、壞死和實(shí)變,肺泡結(jié)構(gòu)消失,有明顯肉芽腫結(jié)節(jié)形成,病變周圍有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而在質(zhì)粒pcAg85B和pcBVP22-Ag85B免疫組小鼠的肺組織中病變明顯減輕,部分肺泡組織消失,可見炎性滲出及輕度肉芽腫反應(yīng),但未見明顯壞死。在BCG免疫組小鼠的肺組織中肺泡結(jié)構(gòu)基本完整,伴有少量炎性反應(yīng)。各實(shí)驗(yàn)組抗酸染色結(jié)果與HE染色結(jié)果相似：在PBS對(duì)照組、空載對(duì)照組和pcBVP22對(duì)照組小鼠的肺組織中結(jié)核桿菌數(shù)量眾多,呈彌漫性簇狀或片狀分布；在質(zhì)粒pcAg85B免疫組小鼠的肺組織中結(jié)核桿菌呈小片狀散在分布,數(shù)量較陰性對(duì)照組明顯減少；在pcBVP22-Ag85B和BCG免疫的小鼠的肺組織中結(jié)核桿菌呈零星散在分布,數(shù)目稀少。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常未感染小鼠相比,結(jié)核桿菌感染導(dǎo)致小鼠脾內(nèi)CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率明顯升高(14.2%vs0.4%)。質(zhì)粒pcAg85B, pcBVP22-Ag85B以及BCG免疫接種均降低了感染小鼠脾細(xì)胞中CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率,三組分別為1.2%、0.9%、0.6%,與PBS對(duì)照組相比差異顯著。與質(zhì)粒pcAg85B組相比,pcBVP22-Ag85B質(zhì)粒組小鼠脾細(xì)胞中的CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率進(jìn)一步降低,但仍略高于BCG組。 結(jié)論：與陰性對(duì)照組相比,兩種質(zhì)粒(pcAg85B和pcBVP22-Ag85B)免疫均可顯著抑制結(jié)核桿菌在小鼠脾、肺組織中的繁殖,明顯減輕小鼠肺組織中的病理反應(yīng),延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間,有效保護(hù)實(shí)驗(yàn)小鼠抵抗結(jié)核桿菌H37Rv毒株的攻擊感染。與BVP22融合表達(dá)的DNA疫苗的保護(hù)效應(yīng)明顯超過單表達(dá)Ag85B的DNA疫苗,其保護(hù)效應(yīng)接近于BCG。此外,DNA疫苗接種和BCG接種均可減少感染小鼠脾臟中CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率,融合表達(dá)的DNA疫苗比單表達(dá)Ag85B的DNA疫苗作用更明顯。我們推測(cè)融合表達(dá)的DNA疫苗在小鼠中表現(xiàn)出較單表達(dá)結(jié)核桿菌Ag85B的DNA疫苗更好的保護(hù)力可能與融合表達(dá)的DNA疫苗免疫原性更強(qiáng)有關(guān)。此外,融合表達(dá)的DNA疫苗的更好表現(xiàn)是否還與它能進(jìn)一步降低小鼠脾臟中CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率有關(guān)?我們的推測(cè)尚有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。
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【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 肖少波;偽狂犬病毒gC基因“自殺性”DNA疫苗及VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的免疫增強(qiáng)效應(yīng)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

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本文編號(hào)：1439509