本文關鍵詞：C57小鼠肝臟內質網蛋白質翻譯后修飾研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2008年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 內質網是細胞中重要的細胞器結構,細胞無論是自身正常的生理變化還是由于對環(huán)境的應激反應而使蛋白質產生上調或下調的變化,大部分都要通過內質網來實現(xiàn),這是因為細胞內質網負責合成分泌到細胞外或是定位到細胞膜、線粒體和溶酶體等細胞器的蛋白質。另外細胞大部分的脂類都在內質網中合成;內質網還擔負著細胞解毒和鈣離子儲存等功能。 在目前已知的蛋白質200多種翻譯后修飾中,糖基化修飾和磷酸化修飾是最為主要和分布最廣的翻譯后修飾方式。蛋白質糖基化修飾極大程度地改變了蛋白質的理化性質:分子量增加、溶解性增大等;并影響著蛋白質的功能。細胞內50%的蛋白質是糖基化修飾蛋白質,對生物樣本中糖蛋白的修飾位點和糖型進行系統(tǒng)的研究,有助于闡明由于糖基化位點或是糖型改變引起的疾病的發(fā)病機理。但是由于糖基化修飾本身存在微不均一性等特點,使糖基化修飾成為目前蛋白質組研究的難點之一。蛋白質的磷酸化修飾在生命活動中具有重要的調控作用,它幾乎涉及所有的生理及病理過程,如代謝、細胞的生長發(fā)育、癌變等,是目前蛋白質組中翻譯后修飾研究的熱點,系統(tǒng)地對生物樣本中磷酸化蛋白質組進行研究,有助于闡明磷酸化介導的生理病理機制;但是磷酸化蛋白質在樣本中含量低且動態(tài)范圍廣,這些特點決定了其相關研究的挑戰(zhàn)性。 本文以C57小鼠肝臟內質網為模式樣本,對內質網蛋白質的N-糖基化修飾和磷酸化修飾進行了研究。 論文第一部分建立了基于ConA富集的內質網N-糖蛋白質組研究策略。ConA是特異性較好的凝集素,在N-糖修飾蛋白質的研究中廣泛使用,為了更好的富集生物樣品中低豐度的N-糖修飾蛋白質,我們首先對ConA的使用條件進行了優(yōu)化,并把優(yōu)化后的使用條件用于內質網N-糖修飾的研究。采用密度梯度離心方法提取小鼠肝臟內質網,并利用ConA富集其中的N-糖修飾蛋白質,通過高準確度的線性離子阱-傅立葉變換回旋共振質譜(LTQ-FTICR-MS)對提取的N-糖修飾蛋白質進行了鑒定和修飾位點確認。實驗分別在樣品水平和質譜水平各進行了三次重復,得到了9批數(shù)據(jù),從這9批數(shù)據(jù)中共鑒定了屬于212個蛋白的309個糖基化肽段,含有323個糖基化修飾位點,其中有81個蛋白質的糖基化修飾位點未被Swissprot庫收錄。 論文第二部分以9種標準蛋白質及線粒體蛋白質為樣本,優(yōu)化了富集磷酸化肽段的SCX技術路線,并將優(yōu)化后的SCX富集路線應用于小鼠肝臟內質網蛋白質的磷酸化研究。在質譜水平進行了3次重復鑒定,得到3批數(shù)據(jù),從這3批數(shù)據(jù)中共鑒定到了249個磷酸化位點,分屬于161個磷酸化蛋白質的164個磷酸化肽段。其中有125個蛋白質的磷酸化修飾位點未被Swissprot庫收錄。分析發(fā)現(xiàn)其中很多磷酸化蛋白質在生物體中發(fā)揮著與肝臟的生理和病理密切相關的重要功能。 本研究建立了基于ConA富集的N-糖蛋白質研究策略,同時優(yōu)化了基于SCX富集的磷酸化研究策略,首次建立了N-糖基化蛋白質修飾譜和小鼠肝臟內質網磷酸化蛋白質修飾譜,為研究N-糖基化修飾、磷酸化修飾在內質網中的功能發(fā)揮及內質網相關功能的研究奠定了基礎。
[Abstract]:The endoplasmic reticulum ( ER ) is an important organelle structure in the cell , and the changes of the protein production up - regulated or down - regulated due to the stress response to the environment , most of which are to be realized through the endoplasmic reticulum , because the endoplasmic reticulum of the cell is responsible for the synthesis of the protein secreted into the cell or the organelle such as the cell membrane , mitochondria and lysosomes . Glycation modification and phosphorylation modification are the most important and widely distributed post - translational modifications in the currently known protein 200 . The protein glycosylation modification greatly alters the physical and chemical properties of proteins : the increase of molecular weight , the increase of solubility , etc . In this paper , the N - glycosylation modification and phosphorylation modification of the endoplasmic reticulum protein were studied by taking C57 mouse liver endoplasmic reticulum as a model sample . In the first part , we have established the research strategy of N - sugar protein in the endoplasmic reticulum , which is based on the concentration of N - sugar . In order to enrich the N - sugar modified protein with low abundance in biological sample , we first optimize the use condition of Con A and use the optimized conditions for N - sugar modification of endoplasmic reticulum . In the second part , nine standard proteins and mitochondrial proteins were used as samples to optimize the SCX technology route for enriching phosphorylated peptide segments , and the optimized SCX enrichment route was applied to the phosphorylation of protein in liver endoplasmic reticulum . In this paper , we established a research strategy of N - sugar protein based on concanavalin enrichment , meanwhile , optimized the phosphorylation research strategy based on SCX enrichment , established the modified spectrum of N - glycosylation protein modification and the phosphorylation protein modification of mouse liver endoplasmic reticulum , and laid a foundation for the study of the function of N - glycosylation modification and phosphorylation modification in the endoplasmic reticulum and the related function of endoplasmic reticulum .

【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R341

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