發(fā)布時間：2018-01-14 10:33

  本文關(guān)鍵詞：NOV基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大鼠真皮多能干細(xì)胞成神經(jīng)分化中的作用研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的損傷修復(fù)一直是困擾神經(jīng)科學(xué)工作者的大難題。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一旦損傷便不能恢復(fù)。近20年來隨著神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展,尤其是干細(xì)胞的出現(xiàn)使人們觀念發(fā)生改變,逐漸認(rèn)識到成年CNS再生是由神經(jīng)元的固有特性(intrinsic properties)和其所處的環(huán)境(environmental cues)共同決定的。因此增加受損神經(jīng)元的再生潛能,改善軸突再生的微環(huán)境成為CNS損傷修復(fù)的基點。 神經(jīng)損傷后修復(fù)的難點之一是神經(jīng)元再生困難,近年來隨著干細(xì)胞研究的迅猛發(fā)展,組織和細(xì)胞移植治療成為大家最為關(guān)注的方法之一。選擇合適的種子細(xì)胞是細(xì)胞移植最核心的問題。目前用于移植的細(xì)胞供體主要是胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSC)、來源于神經(jīng)系統(tǒng)的具有促神經(jīng)再生作用的細(xì)胞(如神經(jīng)膜細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞等),以及其他具有成神經(jīng)分化潛能的成體干細(xì)胞。盡管這些細(xì)胞在CNS損傷修復(fù)移植治療中均顯示出不同程度的積極作用,但由于細(xì)胞來源局限、取材不易、免疫排斥以及倫理道德等諸多方面的問題,臨床應(yīng)用受到很大限制。因此,尋找新的種子細(xì)胞來源成為當(dāng)務(wù)之急。皮膚是人體最大的器官,包括來源于三個胚層的多種不同的組織細(xì)胞,自我更新和再生修復(fù)速度快,是成體干細(xì)胞分離和研究的良好對象。真皮多能干細(xì)胞(Dermal multipotent stem cells,DMSCs)是一種新近分離成功的具有高度增殖能力和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞,具有分化為脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的能力。相對于其他移植供體細(xì)胞而言,DMSCs具有來源豐富、容易獲得、可自體移植、具有更少的“譜系傾向性”等優(yōu)點。避免了胚胎倫理學(xué)、來源不足、異體排斥等弊端。更有研究表明,DMSCs移植治療脊髓損傷時,不僅能外在補充缺失神經(jīng)元,同時可通過分化產(chǎn)生Schwann cells促進(jìn)軸突再生及髓鞘化。顯示了DMSCs在CNS損傷修復(fù)中的良好應(yīng)用前景,有望成為細(xì)胞移植及組織工程的新寵。 在神經(jīng)損傷修復(fù)中,除細(xì)胞移植外在補充缺失神經(jīng)元外,利用基因工程方法改善損傷局部微環(huán)境是治療的另一個側(cè)重點。腎母細(xì)胞瘤過度表達(dá)基因(Nephroblastoma Overexpression gene,NOV)是1991年發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因,其所編碼產(chǎn)物(NOV蛋白)是一種胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor, IGF)相關(guān)蛋白(IGF-relation proteins, IGF-rPs ),屬于IGF超家族的成員。NOV基因是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的一個調(diào)控因子,與動物CNS的損傷和修復(fù)之間存在一定的關(guān)系。NOV基因可通過IGF依賴或者非依賴的方式發(fā)揮作用,參與CNS損傷后的再生和修復(fù)過程。NOV基因的真核表達(dá)載體可以表達(dá)和釋放NOV蛋白,促進(jìn)內(nèi)源和外源性NSC向神經(jīng)元的分化,為CNS再生修復(fù)提供合適的微環(huán)境。NOV基因及其蛋白對DMSCs是否具有類似作用尚未見相關(guān)報道。 擬將DMSCs作為種子細(xì)胞攜載NOV基因進(jìn)入體內(nèi),不但能外在補充CNS損傷中缺失的神經(jīng)元,同時在體發(fā)揮改善損傷局部微環(huán)境的生物學(xué)效應(yīng),結(jié)合NOV基因治療及DMSCs細(xì)胞移植治療雙重優(yōu)勢用于CNS的損傷修復(fù),是本實驗的基本設(shè)計思路。為此本文進(jìn)行了如下研究:(1)含NOV基因的全長序列的真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá);(2)大鼠真皮來源多能干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定;(3)觀察NOV基因及其分泌蛋白對DMSCs增殖和成神經(jīng)分化的影響。通過該項研究為結(jié)合NOV基因工程及DMSCs細(xì)胞移植用于CNS的損傷修復(fù)治療提供初步離體實驗資料。 研究的主要結(jié)果及結(jié)論概述如下: 1、利用RT-PCR的產(chǎn)物,采用定向克隆的方法,通過中間載體pMD-19T,成功地將NOV cDNA全長序列克隆到pEGFP-N1真核表達(dá)質(zhì)粒上,構(gòu)建了pEGFP-N1/NOV融合表達(dá)載體,用抗性菌落篩選、質(zhì)粒酶切鑒定、插入片段序列分析等方法,證明獲得的重組質(zhì)粒完全符合設(shè)計要求,為進(jìn)一步的NOV基因功能研究提供分子平臺。 2、利用早期貼壁傳代培養(yǎng)方法,從新生大鼠真皮中分離培養(yǎng)多能干細(xì)胞,該細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、MTT法測定生長曲線具有良好的自我增殖能力;在一定誘導(dǎo)條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞,具有向外胚層及中胚層細(xì)胞分化的多能性。由此證實了大鼠真皮組織中存在著間充質(zhì)干細(xì)胞,為干細(xì)胞移植治療提供了又一新的種子細(xì)胞來源。 3、在構(gòu)建了NOV基因真核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法首次將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入DMSCs中,流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率約30%。經(jīng)G418篩選陽性克隆、多次傳代純化后用RT-PCR法檢測到NOV重組質(zhì)粒在DMSCs中穩(wěn)定表達(dá)。表明DMSCs可作為NOV基因的細(xì)胞載體。 4、通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀及MTT法研究NOV基因轉(zhuǎn)染對DMSCs增殖性的影響,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了NOV基因的DMSCs較對照組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例下降,細(xì)胞倍增時間提前,增殖能力提高一倍。提示NOV基因能刺激DMSCs的增殖。 5、收集培養(yǎng)NOV/DMSCs細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(NOV-CM),結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及免疫細(xì)胞化學(xué)法,研究NOV基因及其分泌蛋白對DMSCs分化的影響,結(jié)果顯示NOV-CM可以促進(jìn)DMSCs向神經(jīng)元方向分化,分化細(xì)胞中神經(jīng)元比例增高,且細(xì)胞突起較對照組明顯延長。NOV基因轉(zhuǎn)染亦具有同樣的作用。 綜上所述,我們準(zhǔn)確的構(gòu)建了含NOV基因全長序列的真核表達(dá)載體,成功分離、培養(yǎng)并鑒定了新生大鼠真皮多能干細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上,采用脂質(zhì)體法首次將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至DMSCs中,并且NOV基因在其中穩(wěn)定表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明NOV基因及其分泌蛋白可以顯著提高DMSCs增殖性、促進(jìn)DMSCs向神經(jīng)元方向分化并有助于突起形成。該實驗結(jié)果提示DMSCs不僅可作為一種新的種子細(xì)胞來源,且攜載了NOV基因的DMSCs具有細(xì)胞移植及基因工程雙重優(yōu)勢,不但外在補充缺失神經(jīng)元,同時可改善損傷局部微環(huán)境,有望在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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1 席照房;ARC及IGF-1在AS肉雞中抗心肌細(xì)胞凋亡作用的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

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本文編號：1423208