本文關鍵詞：抗2型登革病毒M蛋白和NS1蛋白單克隆抗體的制備及鑒定　出處：《重慶醫(yī)科大學》2008年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 登革病毒 M蛋白 NS1蛋白 單克隆抗體

【摘要】： 目的:近年來,登革病毒(DV)在世界許多國家和地區(qū),尤其是東南亞流行趨勢加重,已成為全球嚴重的公共衛(wèi)生問題。由于目前尚無有效預防登革病毒感染的疫苗上市,而登革出血熱和登革熱休克綜合征的死亡率較高,因此早期快速準確的診斷登革病毒感染就顯得尤為重要。目前新問市的登革病毒感染診斷試劑主要是以全病毒或重組E蛋白為檢測抗原,其特異性和靈敏性有待進一步深入研究。 本研究擬利用2型登革病毒New Guinea C株(NGC株)重組質�？寺”磉_重組M蛋白和NS1蛋白,制備抗2型登革病毒M蛋白和NS1蛋白的單克隆抗體,并對其生物學特性進行了鑒定,為下一步制備快速檢測登革病毒感染的膠體金試紙條奠定基礎。 方法:誘導表達含DV2 prm、ns1基因的原核表達重組載體pET-32a(+)/prM、pET-32a(+)/M、pQE-30/NS1,并且采用了Ni~(2+)-NTA樹脂親和層析純化重組蛋白,以SDS-PAGE進行初步鑒定,并以兔抗登革病毒免疫血清鑒定其免疫活性。以重組蛋白免疫Balb/c小鼠,采用雜交瘤技術制備抗登革病毒重組蛋白的McAb,采用間接ELISA方法和Western blot進行McAb特異性鑒定;同時采用間接ELISA方法鑒定McAb的Ig亞類、效價及親和力進行分析。 結果:重組蛋白pET-32a(+)/M、pQE-30/NS1以上清和包涵體表達,用兔抗登革病毒血清檢測發(fā)現上清中蛋白抗原活性強。利用Ni~(2+)-NTA樹脂親和層析方法,從上清中純化蛋白獲得成功。 通過雜交瘤技術成功獲得3株可分泌特異性McAb的雜交瘤細胞Ⅲ1A6,Ⅲ3D2和Ⅲ4C3。其中Ⅲ1A6,Ⅲ4C3的抗體亞類均為IgG1;Ⅲ3D2的抗體亞類為IgG2a。細胞培養(yǎng)上清的效價分別為1:10~6 , 1:10~5和1:10~6;3株單抗的親和常數均在10~7以上。Western bolt檢測證明3株雜交瘤細胞所分泌的McAb特異性良好。 結論:成功地制備出抗M蛋白的2株McAb和抗NS1蛋白的1株McAb,為進一步建立快速特異檢測登革病毒感染的實驗方法提供了有力的工具。
[Abstract]:Objective: in recent years, dengue virus (DV) in many countries and regions in the world, especially in Southeast Asia increased trend, has become a serious public health problem in the world. Due to lack of effective prevention of listed dengue virus infection and vaccine, dengue fever and dengue shock syndrome with high mortality, early diagnosis fast and accurate dengue virus infection is particularly important. At present, the new asked the city of dengue virus infection is the main diagnostic reagent of whole virus or recombinant E protein as antigen specificity and sensitivity needs further study.
This study intends to use the 2 dengue virus type New Guinea strain C (NGC strain) expression of recombinant M protein and NS1 protein in recombinant plasmid cloning and preparation of anti dengue virus type 2 monoclonal antibody of M protein and NS1 protein, and its biological characteristics were identified, and laid the foundation for the next step of preparation for rapid detection the colloidal gold test strip of dengue virus infection.
Methods: expression containing DV2 PRM, Recombinant Prokaryotic expression vector of pET-32a gene of NS1 (+) /prM (+) pET-32a, /M, pQE-30/NS1, and the use of Ni~ (2+) affinity purification of recombinant protein -NTA chromatography resin, were identified by SDS-PAGE, and the Rabbit anti dengue virus immune serum immune activity identification with the recombinant Balb/c protein immune mice were prepared by hybridoma technique of anti dengue virus recombinant protein McAb by indirect ELISA method and Western blot McAb specific Ig subclass identification; the indirect ELISA method of McAb identification, and the titer of the affinity analysis.
Results: recombinant protein pET-32a (+) /M and pQE-30/NS1 were expressed in supernatant and inclusion body. The detection of Rabbit anti dengue virus sera showed that the protein antigen in the supernatant was highly active. Ni~ (2+) -NTA resin affinity chromatography was applied to purify the protein from the supernatant.
By using the hybridoma technique successfully obtained hybridoma cell lines can secrete 3 III 1A6 specific McAb, 3D2 and 4C3. III III 1A6 III, III 4C3 antibody subclasses were IgG1; III 3D2 antibody subclasses supernatant for IgG2a. cell titer were 1:10~6, 1:10~5 and 1:10~6; the specificity of McAb 3 the affinity constants were single strains of anti.Western in 10~7 or bolt proved that the secretion of 3 hybridoma cells.
Conclusion: 2 McAb and 1 NS1 McAb resistant to M protein were successfully prepared, which provided a powerful tool for further establishment of a rapid and specific detection method for dengue virus infection.

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 楊璐;徐俊榮;顧兵;;免疫固定電泳技術對多發(fā)性骨髓瘤的分型診斷及預后判斷價值[J];檢驗醫(yī)學與臨床;2011年16期

2 黃振林;甄云;胡少杰;李偉蓮;陳麒聲;李玉虎;;腦血管淀粉樣病變相關的腦出血的臨床治療研究[J];中國醫(yī)藥指南;2011年16期

3 楊杰;饒賢才;;登革病毒包膜E蛋白III區(qū)[J];生命的化學;2011年03期

4 張曉飛;張映琦;陳康寧;史樹貴;范文輝;胡俊;;POEMS綜合征29例臨床分析[J];疑難病雜志;2011年07期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關會議論文 前10條

1 陳文捷;潘宇;左麗;;登革病毒感染免疫機制的初步研究[A];中國免疫學會第四屆學術大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

2 朱汝南;錢淵;趙林清;鄧潔;王芳;;北京地區(qū)人偏肺病毒的P和M蛋白基因序列分析[A];第6次全國微生物學與免疫學大會論文摘要匯編[C];2004年

3 錢平;童光志;仇華吉;王云峰;周彥君;劉光清;吳丹;薛強;陳煥春;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白在酵母系統(tǒng)中的表達[A];中國生物工程學會第三次全國會員代表大會暨學術討論會論文摘要集[C];2001年

4 趙衛(wèi);李玉靜;曹虹;;登革病毒感染模型研究進展及在中醫(yī)上的應用[A];新發(fā)和再發(fā)傳染病防治熱點研討會論文集[C];2009年

5 朱禮華;趙彤言;陸寶麟;;媒介蚊蟲對登革病毒感染Balb/C實驗小鼠的增強作用的研究[A];昆蟲與環(huán)境——中國昆蟲學會2001年學術年會論文集[C];2001年

6 戚亭;崔尚金;張超范;;截短的豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白的原核表達[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第三屆豬病防控學術研討會論文集[C];2008年

7 呂應堂;;Ca~(2+)CaM蛋白激酶在水稻體內的免疫定位分析[A];西部大開發(fā) 科教先行與可持續(xù)發(fā)展——中國科協(xié)2000年學術年會文集[C];2000年

8 張勤奮;陳森雄;鄧瑩;盧p樣，

本文編號：1417878