本文關(guān)鍵詞：碘缺乏和甲狀腺功能減退損傷海馬空間和條件學(xué)習(xí)記憶及其CaMKⅡ和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的機制研究　出處：《中國醫(yī)科大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 碘是人體必不可少的微量元素之一,是甲狀腺激素合成的重要原料,并影響甲狀腺激素的合成與分泌。甲狀腺激素是正常生長發(fā)育所必需的激素,具有促進組織分化、生長與發(fā)育成熟的作用,對腦的發(fā)育尤為重要。海馬是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵腦區(qū),對甲狀腺激素敏感。在發(fā)育的關(guān)鍵期,短暫的甲狀腺激素缺乏,會導(dǎo)致海馬區(qū)域神經(jīng)系統(tǒng)功能上的破壞和不可逆性的損傷,對海馬神經(jīng)發(fā)育以及突觸可塑性產(chǎn)生極大的影響,嚴(yán)重的甲狀腺激素缺乏可導(dǎo)致被動躲避、空間學(xué)習(xí)和操作式條件反射受損。鈣離子-鈣調(diào)蛋白-鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶途徑(以下簡稱為CaMKⅡ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)和腺苷酸環(huán)化酶/cAMP-依賴性蛋白激酶途徑(以下簡稱為MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)是在學(xué)習(xí)與記憶形成過程中重要的第二信使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。在腦發(fā)育過程中碘缺乏和甲狀腺功能減退如何影響學(xué)習(xí)記憶形成及CaMKⅡ和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚不清楚,其對海馬CA1、CA3和DG區(qū)的影響作用如何也有待研究。我們采用碘缺乏飼料和不同劑量的PTU飲水建立碘缺乏和甲狀腺功能減退模型,研究仔鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn),及學(xué)習(xí)記憶前后海馬CA1、CA3和DG區(qū)CaMKⅡ和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的改變,以在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白分子水平上闡明碘缺乏和甲狀腺功能減退損害神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶功能的機制。 實驗方法 1、實驗動物與分組 健康2月齡雌性Wistar大鼠,交配妊娠后,取孕鼠28只,按體重隨機分成對照組、5 ppm組、15ppm組和碘缺乏組,每組7只孕鼠。自GD6起,碘缺乏組飼以缺碘地區(qū)糧食配制的飼料,飲用自來水;5ppm組和15ppm組孕鼠分別給予5 ppm和15ppm PTU飲水,普通飼料,至仔鼠PN28時恢復(fù)正常飼料和飲水。在整個試驗過程中,測定母鼠及仔鼠體重,觀察仔鼠開眼情況 2、血清TSH、TH測定 分別于PN14、PN21、PN28和PN42時,取仔鼠心臟采血,3000rpm離心5min,分離血清。采用固相化學(xué)免疫發(fā)光法測定血清中TSH、FT_3和FT_4含量。 3、仔鼠海馬重量測定 分別于PN14、PN21、PN28和PN42時每組取3只仔鼠,乙醚麻醉后斷頭,取腦,剝離雙側(cè)海馬,稱重。 4、海馬CA1、CA3和DG區(qū)免疫組織化學(xué)蛋白表達分析 分別于PN7、PN14、PN21和PN28時每組取5只仔鼠,4%多聚甲醛灌流固定大腦,石蠟包埋,切片。免疫組織化學(xué)染色,觀察海馬CA1、CA3和DG區(qū)總CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CaN、Ng、BDNF、總ERK1/2、p-ERK1/2、總CREB、p-CREB的免疫表達。用圖象分析系統(tǒng)及圖象分析軟件分析海馬CA1、CA3和DG區(qū)各蛋白表達的總積分光密度。 5、海馬CA1、CA3和DG區(qū)western blot蛋白測定分析 分別于PN14、PN21和PN28時,每組選取3只仔鼠,斷頭取腦,剝離海馬,分離CA1、CA3和DG區(qū),采用western blot方法分別測定海馬CA1、CA3和DG區(qū)CaM、總CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CaN、Ng、BDNF、總ERK1/2、p-ERK1/2、總CREB、p-CREB的蛋白。全自動凝膠成像分析系統(tǒng)照相,測得各條帶的凈光密度值。 6、水迷宮實驗 在PN30時,將仔鼠置于水迷宮,了解安全臺階的存在后,將其放于起點,自由游泳,記錄其進入盲端的錯誤次數(shù)以及爬上安全臺階的時間(即潛伏期)。訓(xùn)練3天后,自第4天起,將仔鼠置于迷宮最遠端作為游泳起點,記錄2分鐘內(nèi)仔鼠進入盲端的錯誤次數(shù)和潛伏期,進行分析。 7、穿梭箱實驗 在PN37時,將仔鼠放入穿梭箱中,給予10s峰鳴刺激,仔鼠若完成穿梭,則該次循環(huán)結(jié)束,稱為主動逃避;若未完成,則給予10s電擊刺激,使其完成穿梭,相應(yīng)的電擊結(jié)束,稱為被動逃避。如此反復(fù)循環(huán)10次。共記錄6天的結(jié)果,進行數(shù)據(jù)分析。 8、學(xué)習(xí)記憶過程影響CaMKⅡ和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的測定 在穿梭箱實驗完成后(即PN42時),立刻每組隨機取5只仔鼠,灌流固定,石蠟包埋、切片后,免疫組織化學(xué)染色,觀察海馬CA1、CA3和DG區(qū)Ca~(2+)和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑各蛋白的免疫表達。每組隨機取3只仔鼠,斷頭取腦,剝離海馬,分離CA1、CA3和DG區(qū)后,采用western blot方法分別測定海馬CA1、CA3和DG區(qū)CaMKⅡ和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑各蛋白的水平。 9、統(tǒng)計分析 結(jié)果表示為mean±S.E.M.。全部數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(ANOVA)比較各組間的統(tǒng)計學(xué)差異,當(dāng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義時,用SNK進行組間比較。采用獨立樣本t檢驗比較PN28和PN42間數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 實驗結(jié)果 1、母鼠和仔鼠體重及仔鼠海馬重、開眼率結(jié)果 碘缺乏與甲狀腺功能減退可影響母鼠和仔鼠體重,孕期和哺乳期碘缺乏組母鼠體重明顯低于對照組(P＜0.05);5ppm組、15ppm組和碘缺乏組仔鼠體重增長緩慢,海馬重量減輕,均顯著低于正常水平(P＜0.05)。15ppm組和碘缺乏組仔鼠開眼延遲,同期開眼率明顯低于對照組(P＜0.05)。 2、TSH和TH水平 甲狀腺功能減退可通過反饋作用促進TSH分泌增多,FT_3和FT_4水平下降。在PN14、PN21和PN28時,與對照組相比,5ppm組和15ppm組TSH水平顯著升高(P＜0.05),碘缺乏組無明顯變化;15ppm組和碘缺乏組的FT_3和FT_4水平明顯下降(P＜0.05)。停用PTU和碘缺乏飼料后(PN42),TSH和TH水平均恢復(fù)正常。 3、海馬CA1、CA3和DG區(qū)免疫組織化學(xué)蛋白表達結(jié)果 PN14、PN21和PN28時,在CA1和CA3區(qū),15ppm組和碘缺乏組仔鼠海馬CaMKⅡ、Ng、BDNF、ERK1/2和CREB表達顯著低于對照組,CaN的表達顯著高于對照組,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在DG區(qū),15ppm組和碘缺乏組仔鼠海馬CaMKⅡ、CaN、BDNF和CREB表達顯著低于對照組(P＜0.05),而Ng和ERK1/2與對照組相比無顯著差異。PN7時,各區(qū)均幾乎觀察不到陽性反應(yīng)產(chǎn)物,各組間蛋白表達無顯著差異。 4、海馬CA1、CA3和DG區(qū)western blot蛋白測定結(jié)果 在CA1和CA3區(qū),15ppm組和碘缺乏組仔鼠海馬CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CaM、Ng、BDNF、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB和p-CREB蛋白水平顯著低于對照組,CaN則高于對照組,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在DG區(qū),15ppm組和碘缺乏組仔鼠海馬CaMKⅡ、CaN、BDNF、CREB和p-CREB蛋白水平顯著低于對照組(P＜0.05),而p-CaMKⅡ、CaM、Ng、ERK1/2和p-ERK1/2與對照組相比無顯著差異。 5、神經(jīng)行為學(xué)結(jié)果 在水迷宮實驗測試期,15ppm組和碘缺乏組仔鼠的潛伏期和進入各盲端的錯誤次數(shù)明顯多于對照組和5ppm組;在穿梭箱實驗第3-6天,15ppm組和碘缺乏組遭電擊次數(shù)、主動和被動回避時間明顯多于對照組與5ppm組,均具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 6、學(xué)習(xí)記憶過程對CaMKⅡ和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響 在神經(jīng)行為學(xué)實驗后,對照組除CaN明顯下降外,其余各蛋白的表達水平均顯著上升(P＜0.05);15ppm組和碘缺乏組在CA1和CA3區(qū)各蛋白的表達水平無明顯變化,但仍明顯低于對照組,而CaN顯著高于對照組,具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在DG區(qū),15ppm組和碘缺乏組CaN明顯降低,p-CaMKⅡ、CaM、Ng、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB和p-CREB的蛋白表達均顯著高于神經(jīng)行為學(xué)實驗前。 結(jié)論 1、碘缺乏和甲狀腺功能減退可影響大鼠仔鼠發(fā)育,使其體重下降,海馬重量減輕,開眼延遲。 2、碘缺乏和甲狀腺功能減退可增加海馬CA1和CA3區(qū)CaN活性,下調(diào)CaMKⅡ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白水平;在DG區(qū),碘缺乏和甲狀腺功能減退不影響p-CaMKⅡ、CaM和Ng的蛋白表達。 3、碘缺乏和甲狀腺功能減退可下調(diào)海馬CA1和CA3區(qū)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白水平;在DG區(qū),碘缺乏和甲狀腺功能減退不影響ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表達。 4、碘缺乏和甲狀腺功能減退可損傷仔鼠空間和條件學(xué)習(xí)記憶,使其找到安全區(qū)域的潛伏期及主動和被動躲避時間延長,進入迷宮盲端的錯誤次數(shù)和遭電擊次數(shù)增加。與神經(jīng)行為學(xué)實驗前相比,海馬CA1和CA3區(qū)CaMKⅡ和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白水平無明顯變化,DG區(qū)p-CaMKⅡ、CaM、Ng、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB和p-CREB的蛋白表達均顯著升高,CaN表達下降。 5、碘缺乏和甲狀腺功能減退損傷仔鼠空間和條件學(xué)習(xí)記憶形成的機制可能是由于其增加海馬CA1和CA3區(qū)CaN活性,下調(diào)CaMKⅡ和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白水平,從而損傷神經(jīng)細胞突觸可塑性,影響正常腦發(fā)育和神經(jīng)回路的形成,導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能下降。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R363

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本文編號：1417387