纖連蛋白及其重組肝素結合域多肽對血管內(nèi)皮細胞損傷的影響
本文關鍵詞:纖連蛋白及其重組肝素結合域多肽對血管內(nèi)皮細胞損傷的影響 出處:《福建醫(yī)科大學》2008年碩士論文 論文類型:學位論文
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【摘要】: 血管內(nèi)皮細胞具有非常重要的生理功能,主要體現(xiàn)在:1.構成天然屏障,維持血管內(nèi)膜光滑,防止血小板和白細胞粘附及有害物質(zhì)侵入血管壁;2.組成滲透性屏障,調(diào)節(jié)物質(zhì)交換和主動轉運功能;3.參與血栓形成和止血過程,保持動態(tài)平衡,包括組織纖溶酶原激活物(t-PA)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)等。許多病理狀態(tài)如嚴重感染、DIC等均涉及血管內(nèi)皮細胞的功能損害,繼而加劇病理性過程,形成惡性循環(huán)。因此如何恢復病理狀態(tài)下失衡的血管內(nèi)皮細胞的形態(tài)與功能一直是學術界研究的重點。纖連蛋白(Fibronectin,FN)是一種廣泛存在于細胞外液、細胞表面及結締組織等處的糖蛋白。在抗感染、維持微血管完整性及通透性等方面具有重要的作用,故曾有“調(diào)理性α2表面結合蛋白”、“細胞表面蛋白”及“細胞粘附分子”之稱。已知FN主要分為細胞型和血漿型兩種,細胞型FN主要由內(nèi)皮細胞及成纖維細胞合成,它對于內(nèi)皮細胞之間的連接及內(nèi)皮細胞附著于內(nèi)皮下層的膠原纖維起重要作用,從而保證了微血管完整性。因此,研究外源性FN對某些病理因素造成血管內(nèi)皮細胞損傷的修復作用是很有價值的,鑒于從血漿分離FN存在著血漿資源不足和可能傳播血源性傳染病的問題,同時還由于FN分子量大,達450KD,全分子表達又存在技術上的難題。因此利用基因工程技術表達FN的功能區(qū)多肽并研究其功能,來代替FN可以說是一種可行的辦法。TNF-α是一種重要的炎性介質(zhì),感染等病理情況下TNF-α增加,我們以往的研究表明,FN及肝素結合域多肽可防治脂多糖內(nèi)毒素小鼠DIC的發(fā)生,其機制就涉及抑制TNF-α的表達。因此,根據(jù)前期研究基礎,本實驗的目的在于建立TNF-α損傷血管內(nèi)皮細胞損傷的模型及半乳糖胺增敏的內(nèi)毒素血癥小鼠模型,通過體外和體內(nèi)實驗,研究FN及肝素結構域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP對血管內(nèi)皮細胞的影響。 1.人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)和鑒定采用酶消化法培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞;用免疫組化法檢測Ⅷ因子鑒定內(nèi)皮細胞。 2.FN和兩種肝素結合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP制備用明膠親和層析的方法從人新鮮血漿分離FN;經(jīng)SDS-聚丙烯凝膠電泳和免疫印跡(Western blot)法鑒定FN純度和特異性;兩種肝素結合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP由本研究所自行制備的酵母表達載體中表達和制備。 3.建立TNF-α損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞模型 3.1實驗分組:(1)空白對照組:不加TNF-α處理的正常生長的HUVECs;(2)不同濃度TNF-α處理組:分別用5ng/ml,10 ng/ml,20 ng/mlTNF-α作用18h;(3)不同時間TNF-α處理組:用10 ng/mlTNF-α分別作用6h,12h,,18h,24h。 3.2用ELISA法檢測各組內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清中PAI-1、tPA、sICAM-1的含量 4.研究FN及兩種肝素結合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP對TNF-α作用的內(nèi)皮細胞的影響 4.1實驗分組:(1)空白對照組:不加TNF-α處理的正常生長的HUVECs;(2)TNF-α作用組:10ng/mlTNF-α作用18h,加入與多肽等體積的培養(yǎng)液6h;(3)TNF-α+FNNHBSPP作用組:10ng/ml TNF-α作用18h,加入濃度為600ug/ml的FNNHBSPP作用6h;(4)TNF-α+FNCHBSPP作用組:10ng/mlTNF-α作用18h,加入濃度為600ug/ml的FNCHBSPP作用6h;(5)TNF-α+FN作用組:10ng/mlTNF-α作用18h,加入濃度為600ug/ml的FN作用6h。 4.2用倒置顯微鏡和透射電鏡觀察FN及其兩種肝素結合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP對TNF-α損傷的內(nèi)皮細胞作用下的形態(tài)和超微結構 4.3用ELISA法檢測各組內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清中PAI-1、tPA、sICAM-1的含量 5.研究FN及其兩種肝素結合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP對內(nèi)毒素血癥小鼠肝、肺組織血管內(nèi)皮細胞的影響 5.1建立半乳糖胺增敏的內(nèi)毒素血癥小鼠模型應用半乳糖胺增敏內(nèi)毒素脂多糖建立內(nèi)毒素血癥小鼠模型,即給小鼠腹腔注射半乳糖胺(400mg/kg)和內(nèi)毒素(100ug/kg)。 5.2實驗分組:正常組、內(nèi)毒素血癥組、FN作用組、FNNHBSPP作用組和FNCHBSPP作用組。在注射半乳糖胺及內(nèi)毒素前半小時從其尾靜脈分別注射FN、FNNHBSPP、FNCHBSPP(20mg/kg),內(nèi)毒素血癥組給等體積生理鹽水。 5.3病理形態(tài)學觀察各實驗組小鼠肝、肺組織血管內(nèi)皮細胞腹腔注射藥物9小時后,頸椎脫臼法處死小鼠,取小鼠的肝、肺組織,用10%福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,常規(guī)HE染色,做病理形態(tài)學觀察。 5.4免疫組織化學法檢測肝、肺組織血管內(nèi)皮細胞纖維連接蛋白(FN)表達 取得了以下結果與結論: 1.建立了穩(wěn)定傳代的人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)體系。 2.建立了TNF-α損傷內(nèi)皮細胞的模型,不同濃度的TNF-α(5,10,20ng/ml)作用于HUVECs18h,培養(yǎng)液中PAI-1、sICAM-1的濃度與空白對照組相比,各組均增加(p㩳0.01),其中以10ng/ml的TNF-α作用最明顯;用同一濃度10ng/ml的TNF-α作用6,12,18,24h,與空白對照組相比,PAI-1、sICAM-1的濃度均有明顯增高(p㩳0.01),在18hTNF-α作用最明顯;tPA各組無明顯差異(p㧐0.05)。 3.FN及其肝素結合域多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP作用組的內(nèi)皮細胞,培養(yǎng)液上清中PAI-1及sICAM-1的濃度均比TNF-α組明顯減低(p㩳0.01),FN及兩種多肽的作用無明顯差異(p㧐0.05)。 4.建立了內(nèi)毒素血癥小鼠模型,予FN及多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP作用組的小鼠肝、肺組織血管內(nèi)皮細胞病變明顯減輕,血管內(nèi)皮細胞的FN表達比內(nèi)毒素血癥小鼠增強。 5.結論:FN及其多肽FNNHBSPP、FNCHBSPP對TNF-α及敗血癥所致的血管內(nèi)皮細胞的損傷具有保護作用;FN及其兩種肝素結合域多肽在這方面的作用無明顯差異。
[Abstract]:Vascular endothelial cells have very important physiological functions, mainly reflected in: 1. form a natural barrier, maintain intimal smooth, prevent the adhesion of platelets and leukocytes and harmful substances into the vessel wall; 2. permeability barrier, regulating the material exchange and active transport function; 3. involved in thrombosis and hemostasis, maintain dynamic balance, including tissue plasminogen activator (t-PA), plasminogen activator inhibitor -1 (PAI-1). Many pathological conditions such as severe infection, dysfunction of DIC is involved in vascular endothelial cells, and then aggravate the pathological process, forming a vicious spiral. So how to restore the morphology and function of vascular endothelial cells under pathological conditions has been imbalance the focus of academic research. Fibronectin (Fibronectin, FN) is a widely exist in the extracellular fluid, cell surface glycoproteins and connective tissue and so on. In the dimension of anti infection. Has an important role to microvascular integrity and permeability, so it had "conditioning alpha 2 surface binding protein", "cell surface proteins and cell adhesion molecules called". Known FN is mainly divided into two types of cells and plasma cells, FN is mainly composed of endothelial cells and fibroblasts cell synthesis, for connection between endothelial cells and endothelial cell adhesion to subendothelial collagen fibers play an important role, so as to ensure the microvascular integrity. Therefore, the research of exogenous FN on some pathological factors to repair the injury of vascular endothelial cells with is very valuable, given the separation of FN from plasma exists the plasma resource shortage and problems may spread of infectious diseases, but also because the molecular weight of FN, up to 450KD, the expression and technical problems. Therefore, using genetic engineering expression of FN multi function area Peptide and study its function, it can be said is a feasible way for.TNF- alpha is a kind of important inflammatory mediators instead of FN, infection and other pathological conditions TNF- increased, our previous study showed that FN and heparin binding domain polypeptide can prevent the occurrence of DIC in mice with LPS, the mechanism involves inhibition of expression of TNF- alpha. Therefore, based on the previous research, the purpose of this experiment is that mouse model of endotoxemia model and galactosamine establish damage vascular endothelial cell injury alpha TNF- sensitization, by in vitro and in vivo experiments, the research of FN and heparin domain polypeptide FNNHBSPP, effects of FNCHBSPP on vascular endothelial cells.
1. culture and identification of human umbilical vein endothelial cells by enzyme digestion and cultured human umbilical vein endothelial cells; Determination of factor VIII characterization of endothelial cells by immune group.
2.FN and two kinds of heparin binding domain polypeptide FNNHBSPP, FNCHBSPP method for preparation of gelatin affinity chromatography for separating FN from fresh human plasma; by SDS- polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting (Western blot) method for identification of FN purity and specificity; two heparin binding domain polypeptide FNNHBSPP, FNCHBSPP by the self prepared yeast expression preparation and expression vector.
3. the establishment of TNF- alpha injury human umbilical vein endothelial cell model
3.1 experiment group: (1) blank control group: normal growth HUVECs without TNF- alpha treatment; (2) different concentrations of TNF- alpha treatment group: 5ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/mlTNF- alpha acting 18h respectively; (3) TNF- TNF- treatment group at different time: 6h, 12h, ng/mlTNF-, 10 with ng/mlTNF- ng/mlTNF-.
3.2 the content of PAI-1, tPA, sICAM-1 in cultured supernatant of endothelial cells was detected by ELISA
4. study the effect of FN and two heparin binding domain polypeptide FNNHBSPP, FNCHBSPP on the endothelial cells of TNF- alpha
4.1 experimental groups: (1) blank control group: without the normal growth of TNF- treated HUVECs; (2) TNF- group: alpha 10ng/mlTNF- alpha 18h, 6h liquid added to the culture and peptide volume; (3) +FNNHBSPP group: 10ng/ml TNF- alpha TNF- alpha 18h, concentration of FNNHBSPP was added the role of 6h 600ug/ml; (4) TNF- group: 10ng/mlTNF- alpha +FNCHBSPP alpha 18h, concentration of FNCHBSPP was added 6h 600ug/ml; (5) TNF- group: 10ng/mlTNF- alpha alpha +FN 18h, adding concentration of FN 6h. 600ug/ml
4.2, we observed the morphology and ultrastructure of FN and its two heparin binding domains FNNHBSPP and FNCHBSPP on TNF- injured endothelial cells under inverted microscope and transmission electron microscope.
4.3 the content of PAI-1, tPA, sICAM-1 in cultured supernatant of endothelial cells was detected by ELISA
5. study the effect of FN and its two heparin binding domain polypeptide FNNHBSPP, FNCHBSPP on the vascular endothelial cells of liver and lung tissue of mice with endotoxemia
5.1 a Galacto amine sensitized endotoxemia mouse model was established. Galactoamine sensitized endotoxin lipopolysaccharide (LPS) was used to establish endotoxemia mice model, namely, intraperitoneal injection of galactoamine (400mg/kg) and endotoxin (100ug/kg).
5.2, the experimental group was divided into normal group, endotoxemia group, FN action group, FNNHBSPP action group and FNCHBSPP action group. FN, FNNHBSPP and FNCHBSPP (20mg/kg) were injected from the caudal vein half an hour before injecting galactoamine and endotoxin, and the volume of physiological saline was given to the endotoxemia group.
5.3 pathomorphological observation. After 9 hours of intraperitoneal injection of liver and lung endothelium in each experimental group, the mice were killed by cervical dislocations, and the liver and lung tissues of mice were fixed with 10% formalin and paraffin embedded. Slices were stained with conventional HE staining for pathomorphological observation.
5.4 immunohistochemical method to detect the expression of fibronectin (FN) in the vascular endothelial cells of the liver and lung
The following results and conclusions are obtained.
1. a cultured human umbilical vein endothelial cell culture system was established.
2. the establishment of the endothelial cell injury TNF- alpha model, different concentrations of TNF- alpha (5,10,20ng/ml) in HUVECs18h, medium PAI-1, compared with the blank control group the concentration of sICAM-1, were increased (P? 0.01), of which the most obvious effect of 10ng/ml TNF- alpha TNF- alpha 6,12,18,24h; with the same concentration 10ng/ml, compared with the control group PAI-1, sICAM-1 concentrations were significantly higher (P? 0.01), the most obvious effect of 18hTNF- alpha had no significant difference in tPA group; (P? 0.05).
The concentrations of PAI-1 and sICAM-1 in endothelial cells of 3.FN and heparin binding domain FNNHBSPP and FNCHBSPP groups were significantly lower than those in TNF- group (P? 0.01), but there was no significant difference in FN and two peptides (P 0.05).
4. the establishment of a mouse model of endotoxemia, with FN and FNNHBSPP peptides, mouse liver FNCHBSPP group, lung tissue vascular endothelial cell lesion significantly reduced, vascular endothelial cells, enhanced expression of FN than endotoxaemia in mice.
5. conclusion: FN and its polypeptide FNNHBSPP and FNCHBSPP have protective effects on the injury of vascular endothelial cells induced by TNF- alpha and septicemia. FN and its two heparin binding domain peptides have no significant difference in this aspect.
【學位授予單位】:福建醫(yī)科大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2008
【分類號】:R363
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本文編號:1415286
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