本文關(guān)鍵詞：人MBL-MASPs復(fù)合物及人血清白蛋白單克隆抗體的制備、鑒定與初步應(yīng)用　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： MBL-MASPs復(fù)合物(MBL-MASPs complexes)由甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)和甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)的絲氨酸蛋白酶(MBL-associated serine proteases, MASPs)兩類蛋白分子結(jié)合構(gòu)成。MBL為C型凝集素超家族中膠凝素(collectins)家族成員,是天然免疫系統(tǒng)中一種重要的模式識(shí)別受體。MASPs與補(bǔ)體Cls、C1r同屬絲氨酸蛋白酶亞家族,目前已確認(rèn)的MASP家族成員包括3個(gè)絲氨酸蛋白酶(MASP-1、MASP-2、MASP-3)和1個(gè)非酶蛋白(sMAP),均可與MBL形成復(fù)合體。人血清中MBL含量很低,正常人平均含量水平約1.0mg/L,且與MASPs以一種大分子復(fù)合物的形式存在,因此獲取高純度的MBL-MASPs復(fù)合物、MBL及MASPs蛋白存在困難。血循環(huán)中的MBL-MASPs復(fù)合物有多種,但具體種類、化學(xué)計(jì)量關(guān)系、復(fù)合物形成的調(diào)節(jié)機(jī)制等問題仍不清楚。 MBL可選擇性識(shí)別多種病原體的糖結(jié)構(gòu),通過激活MASP-1、MASP-2和MASP-3進(jìn)一步激活補(bǔ)體凝集素途徑而發(fā)揮溶破和間接調(diào)理功能,并能與吞噬細(xì)胞膠凝素受體(即ClqR)結(jié)合而啟動(dòng)調(diào)理吞噬,還可介導(dǎo)MBL依賴的細(xì)胞毒作用,同時(shí)MBL還是一個(gè)重要的粘膜表面防御分子。 血清MBL缺陷及活性降低可導(dǎo)致調(diào)理吞噬作用缺損,表現(xiàn)為各種病原體的反復(fù)急慢性感染。MBL基因突變還與自身免疫病密切相關(guān),甚至HBV、HIV等特殊病原體的感染及其發(fā)展轉(zhuǎn)歸也與MBL缺損有關(guān)。MASP-2缺陷主要由遺傳多態(tài)性引起,其對(duì)感染性疾病易感性的影響目前還知之甚少。有報(bào)道MASP-2缺陷是化療后感染的危險(xiǎn)因素,腎癌患者尿液中sMAP的含量高于健康人。 由于MBL和MASPs具有上述重要作用,研究其缺損的發(fā)病機(jī)理尤為迫切,而MBL-MASPs復(fù)合物單克隆抗體(單抗)便是進(jìn)行該項(xiàng)研究的重要工具之一。目前國(guó)內(nèi)雖然已有關(guān)于制備MBL單抗的報(bào)道,但仍無國(guó)產(chǎn)商品化試劑,國(guó)外相關(guān)試劑價(jià)格昂貴,因此,自制MBL-MASPs單抗非常必要。 本課題的特色與創(chuàng)新之處在于：從一個(gè)單抗制備過程中,獲得針對(duì)MBL-MASPs復(fù)合物及其各組成成分MBL、MASP1、MASP2以及其不同表位的眾多目的單抗。由于MBL-MASPs復(fù)合物中成分復(fù)雜,因此本課題的難點(diǎn)在于如何對(duì)獲得的各種單抗進(jìn)行特異性鑒定,從目前條件出發(fā),我們初步的解決辦法是使用ELISA、Western blotting、MBL功能阻斷試驗(yàn)并結(jié)合各成分分子量進(jìn)行綜合分析。 在MBL-MASPs復(fù)合物單抗制備、鑒定過程中,我們得到兩株人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)單抗,證明用來免疫小鼠的MBL-MASPs復(fù)合物抗原中含有微量HSA。HSA是血液系統(tǒng)的重要組分,具有結(jié)合和運(yùn)輸內(nèi)源性及外源性物質(zhì),維持血液膠體滲透壓,清除自由基,抑制血小板功能及影響動(dòng)脈血管滲透性等生理作用。臨床上高純度的HSA作為血漿容量擴(kuò)充劑廣泛應(yīng)用于大出血、休克、燒傷、癌癥、紅白細(xì)胞增多癥、白蛋白過少癥等。另外,微量白蛋白尿是糖尿病腎病最早的臨床表現(xiàn),是心血管疾病發(fā)病率和死亡率顯著增高的一個(gè)標(biāo)志,而早期監(jiān)測(cè)尿微量白蛋白水平能夠使個(gè)體化的積極治療及早實(shí)施,達(dá)到預(yù)防或延緩糖尿病腎病向終末期腎病進(jìn)展的目的。鑒于上述HSA的作用和性質(zhì),為了建立靈敏、快速、準(zhǔn)確的微量白蛋白檢測(cè)方法及HSA提純方法,同時(shí)也為了進(jìn)一步純化MBL-MASPs復(fù)合物抗原,使關(guān)于MBL-MASPs復(fù)合物功能性質(zhì)的研究結(jié)果更可信,我們決定應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備HSA單克隆抗體作為必要的工具。 第一章：MBL-MASPs復(fù)合物單克隆抗體的制備、鑒定及初步應(yīng)用 為了研究MBL和MASPs的功能特性及其缺損時(shí)的發(fā)病機(jī)理,我們以MBL-MASPs復(fù)合物為抗原制備單克隆抗體,希望能夠得到針對(duì)MBL-MASPs復(fù)合物及其各組成成分MBL、MASP1、MASP2、MASP3、sMAP以及其不同表位的眾多目的單抗,尤其是針對(duì)MBL與MASPs結(jié)合位點(diǎn)或二者結(jié)合后兩蛋白之間空間結(jié)構(gòu)的單抗。我們采用雜交瘤技術(shù),通過多次細(xì)胞融合及克隆化并用HSA作為抗原進(jìn)行差減篩選,最終建立能分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株。采用ELISA、Western blotting結(jié)合MBL-MASPs復(fù)合物及其各組成成分分子量進(jìn)行特異性鑒定分析,并通過檢測(cè)所得單抗對(duì)MBL功能的阻斷作用進(jìn)一步證明其特異性。結(jié)果總計(jì)獲得22株可能分泌MBL-MASPs復(fù)合物單抗的雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)抗體亞類(型)鑒定,其中10株為IgM亞類,其余12株為IgG亞類。對(duì)于IgM亞類單抗,我們只用間接ELISA法進(jìn)行了初步鑒定,而對(duì)IgG亞類單抗則進(jìn)一步用了Western blotting和MBL功能阻斷試驗(yàn)做了鑒定。結(jié)果表明12株IgG亞類單抗中,有7株可能針對(duì)MBL二聚體或MBL(二聚體)-MASP2(單體)；1株針對(duì)MBL單鏈或MBL多聚體；1株針對(duì)MBL單體、MBL三聚體(含)以上多聚體；1株針對(duì)MBL三聚體,其余兩株分別針對(duì)MASP1和MASP3。其中5A7雜交株與商品化MBL抗體Western blotting結(jié)果相同。我們選取5A7和1C8兩株單抗進(jìn)行了MBL功能阻斷試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)二者均能抑制MBL對(duì)PBMC分泌細(xì)胞因子IL-6、IL-2及IFN-γ的刺激作用,由此印證了這兩株單抗與MBL結(jié)合的特異性。而12株IgG亞類單抗中有無針對(duì)MBL與MASPs結(jié)合位點(diǎn)或二者結(jié)合后兩蛋白之間空間結(jié)構(gòu)的單抗還需進(jìn)一步鑒定。此外,我們還對(duì)純化的MBL-MASPs復(fù)合物單抗進(jìn)行了辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)的標(biāo)記,為以后建立MBL-MASPs復(fù)合物及其相關(guān)成分的ELISA檢測(cè)體系做準(zhǔn)備�？傊�,通過使用雜交瘤技術(shù),我們獲得了MBL-MASPs復(fù)合物的多種單抗并進(jìn)行了初步鑒定,基本達(dá)到了預(yù)期目的,為后續(xù)的MBL功能特性、缺陷時(shí)發(fā)病機(jī)理以及蛋白分離提純等研究工作提供了重要工具。 第二章：人血清白蛋白單克隆抗體的制備、鑒定及初步應(yīng)用 為了建立靈敏、快速、準(zhǔn)確的HSA定量方法及分離提純方法并進(jìn)一步純化MBL-MASPs復(fù)合物抗原,我們應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備HSA單克隆抗體,希望利用HSA單抗建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)體系并制備抗體偶聯(lián)親和層析柱。通過細(xì)胞融合及克隆化篩選,建立特異性雜交瘤株。采用ELISA、Western blotting進(jìn)行特異性鑒定分析,通過交叉配對(duì)法選擇合適的夾心ELISA抗體對(duì),利用棋盤滴定法確定包被抗體和檢測(cè)抗體的適宜工作濃度,制備HSA單抗與CNBr actived Sepharose 4B偶聯(lián)的親和層析柱并鑒定其對(duì)HSA和MBL-MASPs復(fù)合物的分離純化效果。結(jié)果總計(jì)獲得20株分泌HSA單抗的雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)抗體亞類(型)鑒定均為IgG亞類,所得單抗經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化后全部用簡(jiǎn)易過碘酸鈉法進(jìn)行了HRP標(biāo)記。間接ELISA法和Western blotting對(duì)各個(gè)單抗特異性鑒定結(jié)果良好。我們對(duì)其中1C11、2E9、3A5、4H1四株單抗進(jìn)行了較深入的研究,并初步建立了3A5-2E9和2E9-2E9兩個(gè)雙抗體夾心ELISA檢測(cè)體系。前者標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.1764Ln(x)-0.2378,R2=0.9689；后者為y=0.1676Ln(x)-0.2079,R2=0.9663；二者檢測(cè)范圍和靈敏度均相同,分別為16-2000ng/ml和8ng/ml,靈敏度均滿足尿微量白蛋白檢測(cè)要求,但仍有待進(jìn)一步完善和臨床考核。我們用單抗1C11成功制備了抗體偶聯(lián)親和層析柱,Western blotting結(jié)果表明,該層析柱能夠較好地分離提純?nèi)搜搴蚆BL-MASPs復(fù)合物中所含的HSA,換言之,能夠去除MBL-MASPs復(fù)合物中的HSA雜質(zhì),但去除雜質(zhì)后MBL-MASPs復(fù)合物的功能活性尚有待進(jìn)一步鑒定。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1412772