本文關(guān)鍵詞：干擾素-α對神經(jīng)細(xì)胞中p11表達(dá)的影響　出處：《新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景 IFN-α在臨床上應(yīng)用廣泛,如抗病毒、抗腫瘤。但是其中的一個不良反應(yīng),就是長期應(yīng)用會出現(xiàn)精神抑郁,而且發(fā)病率比較高,這就大大限制了IFN-α的臨床應(yīng)用。目前,IFN-α引起抑郁的機(jī)制還有得進(jìn)一步研究。研究報道腦內(nèi)特定區(qū)域p11蛋白表達(dá)的降低與抑郁癥有著密切的關(guān)系,并且p11能夠轉(zhuǎn)運5-羥色胺受體1B(5HTR1B)、5-羥色胺受體4(5HTR4)到細(xì)胞膜,影響兩者在細(xì)胞膜上的表達(dá)。目的探討IFN-a對人神經(jīng)細(xì)胞中p11表達(dá)的影響。 方法 1.p11-cmv-flag表達(dá)基因的構(gòu)建：提取SH-SY5Y細(xì)胞總的RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)已知人的p11基因表達(dá)序列設(shè)計兩端引物,以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,獲得的產(chǎn)物含p11表達(dá)基因的全長。HindⅢ和EcoRI雙酶切p11cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物和Flag-cmv載體,雙酶切后分別將兩者進(jìn)行連接反應(yīng)即獲得p11-cmv-flag質(zhì)粒。 2.p11蛋白表達(dá)的檢測：將p11-cmv-flag表達(dá)質(zhì)粒和Pcmv-flag空質(zhì)粒利用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)入SH-SY5Y細(xì)胞中,檢測p11-flag表達(dá)的情況。 3. IFN-α對p11mRNA表達(dá)的影響：分別用不同濃度(0、50、500、1000、2000、3000IU/ml)的IFN-α刺激SH-SY5Y細(xì)胞18小時后,提取細(xì)胞總的RNA,逆轉(zhuǎn)錄,Real Time PCR檢測p11mRNA的表達(dá)變化。每組設(shè)兩個復(fù)孔,實驗重復(fù)三次。 4. IFN-α對p11蛋白表達(dá)的影響：分別用不同濃度(0、50、500、1000、2000、3000IU/ml)的IFN-α刺激SH-SY5Y細(xì)胞24小時后,提取細(xì)胞總的蛋白,westernblot法檢測P11蛋白的表達(dá)變化；用1000IU/ml的IFN-α分別刺激細(xì)胞Oh、6h、12h、24h、36h、48h后,提取細(xì)胞總的蛋白,westemblot法檢測p11蛋白表達(dá)變化。實驗重復(fù)三次。 5. IFN-α對p11蛋白在胞內(nèi)分布的影響：培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,分別用不同濃度(0、500,3000IU/ml)的IFN-α刺激SH-SY5Y細(xì)胞24小時后,通過固定、封閉、一抗、二抗反應(yīng)后,在免疫熒光共聚焦顯微鏡下觀察p11蛋白的表達(dá)。 6.統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析,實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用單因素方差分析,兩組均數(shù)比較用t檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1.成功構(gòu)建p11-cmv-flag表達(dá)質(zhì)粒,質(zhì)粒測序結(jié)果與NCBI提供序列完全匹配。 2. Western Blot結(jié)果顯示p11-cmv-flag表達(dá)質(zhì)粒能夠在SH-SY5Y細(xì)胞中成功表達(dá)。 3.IFN-α能夠降低SH-SY5Y細(xì)胞p11mRNA的表達(dá)水平。 4.IFN-α能夠降低SH-SY5Y細(xì)胞p11蛋白的表達(dá)水平。 5.免疫熒光共聚焦檢測,SH-SY5Y細(xì)胞實驗組p11蛋白處理組平均綠色熒光強(qiáng)度顯著低于對照組,IFN-α能夠抑制p11在SH-SY5Y細(xì)胞胞膜內(nèi)表面的聚集。 結(jié)論IFN-α能誘導(dǎo)人神經(jīng)細(xì)胞中p11表達(dá)量的減少。
[Abstract]:Background IFN- 偽 is widely used in clinical practice, such as antiviral, anti-tumor. But one of the adverse reactions is long-term use of mental depression, and the incidence is relatively high. This greatly limits the clinical application of IFN- 偽. The mechanism of depression induced by IFN- 偽 has been further studied. It is reported that the decrease of p11 protein expression in specific regions of brain is closely related to depression. Moreover, p11 can transport 5-hydroxytryptamine receptor (5HTR4) to the cell membrane. Objective to investigate the effect of IFN-a on the expression of p11 in human nerve cells. Method 1. Construction of p11-cmv-flag expression gene: total RNAs of SH-SY5Y cells were extracted and reverse transcripted into cDNA. According to the known expression sequence of human p11 gene, the primers were designed and amplified using cDNA as template. The obtained product contains the full-length. Hind 鈪，

本文編號：1390303