本文關(guān)鍵詞：小腸上皮分化相關(guān)microRNA的篩選　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 小腸上皮 絨毛 隱窩 微小RNA 非編碼RNA 芯片 干細(xì)胞 分化 基因表達(dá)調(diào)控

【摘要】：在小腸組織中,單層柱狀上皮可向固有層折疊形成眾多的隱窩結(jié)構(gòu),同時(shí)也向腔面突起形成指狀的絨毛結(jié)構(gòu)。在結(jié)腸只存在隱窩結(jié)構(gòu),大小和細(xì)胞組分在不同部位呈現(xiàn)不同。小腸上皮是個(gè)典型的干細(xì)胞分化系統(tǒng),多種祖細(xì)胞不斷分化成不同的細(xì)胞子系。關(guān)于腸上皮細(xì)胞持續(xù)的產(chǎn)生、分化的分子機(jī)制事關(guān)小腸疾病例如癌癥的發(fā)生、發(fā)展,所以已經(jīng)有廣泛研究。多條信號(hào)通路包括Notch和Wnt通路被認(rèn)為在腸上皮細(xì)胞的增殖和分化調(diào)控中發(fā)揮重要作用。同時(shí)也提示上皮細(xì)胞的定向分化過(guò)程在基因表達(dá)的嚴(yán)格調(diào)控下。 微小RNA (MicroRNAs)是一類有20-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA可以在多個(gè)物種中對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNA可通過(guò)和靶基因的mRNA序列部分互補(bǔ)來(lái)抑制它們的翻譯或者調(diào)解它們的穩(wěn)定性。miRNA可調(diào)控多個(gè)細(xì)胞事件,包括在器官發(fā)育和腫瘤形成中的細(xì)胞增殖分化事件。在本研究中,我們基于改良的腸上皮細(xì)胞分離方法,對(duì)腸上皮細(xì)胞分化相關(guān)的miRNA進(jìn)行篩選。 目的: 1.建立改良的小腸上皮細(xì)胞低溫快速分離的方法 2.用miRNA芯片和Northern blot的方法篩選到腸上皮細(xì)胞分化相關(guān)的miRNA。 材料和方法: 1.腸道上皮的分離和富集 小腸上皮細(xì)胞的隱窩單位、絨毛單位以及結(jié)腸的隱窩單位在低溫條件下應(yīng)用螯合劑進(jìn)行洗脫和分離。上皮細(xì)胞間連接的保持和與基底膜的完整分離用收集細(xì)胞的HE切片來(lái)觀察。固有層來(lái)源的血細(xì)胞污染用CD45的免疫熒光染色來(lái)鑒定。 2.腸上皮細(xì)胞分化miRNA的篩選 小腸上皮的隱窩和絨毛細(xì)胞被分離和分別富集后進(jìn)行RNA提取。18到100nt的小RNA從總RNA中進(jìn)一步純化。經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記,小RNA和miRNA芯片雜交得到小腸隱窩和絨毛細(xì)胞差異miRNA表達(dá)譜。對(duì)差異基因進(jìn)行SAM和cluster分析處理。 3.對(duì)miRNA芯片的相關(guān)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證 挑選6個(gè)隱窩和絨毛細(xì)胞間差異表達(dá)的miRNA用Northern Blot的方法進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果: 1.獲得了高純度的小腸上皮絨毛、隱窩細(xì)胞和結(jié)腸隱窩上皮細(xì)胞。小腸上皮絨毛、隱窩細(xì)胞和結(jié)腸隱窩上皮細(xì)胞在地位條件下被洗脫和富集。固有層腔面的基底膜保存完整。在上皮細(xì)胞富集物中偶見(jiàn)少量CD45表達(dá)陽(yáng)性的造血系統(tǒng)來(lái)源細(xì)胞。 2.腸上皮細(xì)胞分化相關(guān)miRNA的篩選和隱窩細(xì)胞比較,35個(gè)miRNA在絨毛細(xì)胞中差異表達(dá),其中16個(gè)上調(diào)的miRNA(倍數(shù)大于2)和19個(gè)下調(diào)的miRNA(倍數(shù)小于0.7).層次聚類樹通過(guò)cluster軟件生成。 3. miRNA芯片結(jié)果用Northern blot方法驗(yàn)證。來(lái)源于小腸腸段,結(jié)腸腸段,去上皮的小腸腸段,小腸絨毛細(xì)胞,小腸隱窩和結(jié)腸隱窩細(xì)胞的RNA完整性保存良好。這些總RNA用來(lái)電泳和檢測(cè)6個(gè)挑選出來(lái)的差異表達(dá)miRNA。驗(yàn)證結(jié)果顯示六個(gè)中有三個(gè)和芯片結(jié)果一致。相對(duì)于隱窩細(xì)胞,絨毛細(xì)胞上調(diào)miR-183,miR-31,下調(diào)miR-19-b。 結(jié)論: 1.我們成功的建立了改良性的小腸上皮和結(jié)腸上皮細(xì)胞的分離方法 2.我們獲得一系列腸上皮分化相關(guān)的miRNA候選分子。 3.我們確認(rèn)了miR-143, miR-31, miR-22, miR-183, miR-17-5p和miR-19b在小腸和結(jié)腸的表達(dá)模式
[Abstract]:In the small intestine, columnar epithelium can form a recess structure of numerous folding to the natural layer, but also to the cavity surface protrusions formed to villus structure like. There is only in the colon crypt structure, size and cell components show different in different parts. The intestinal epithelial stem cell differentiation is a typical system, a variety of progenitor the cells continue to differentiate into different cell lines. The son of intestinal epithelial cells continue to produce, the molecular mechanism is related to the differentiation of the intestinal diseases such as cancer, development, so has been widely studied. Several signaling pathways including Notch and Wnt pathways are thought to play an important role in regulating the proliferation and differentiation of intestinal epithelial cells at the same time. Also suggested that strict regulation during directional differentiation of epithelial cells in gene expression.
Micro RNA (MicroRNAs) is a kind of non encoding RNA and 20-25 nucleotide can be in multiple species on gene expression of post transcriptional regulation by.MiRNA and the mRNA of target gene sequences complementary to suppress their translation or stability of.MiRNA they can mediate the regulation of multiple cellular events, including cell proliferation and differentiation events in the formation of organs and tumors. In this study, we modified the intestinal epithelial cells based on the separation method of intestinal epithelial cell differentiation related miRNA were screened.
Objective:
1. to establish a modified method for rapid isolation of small intestinal epithelial cells at low temperature
2. miRNA and Northern blot were used to screen the miRNA. related to the differentiation of intestinal epithelial cells
Materials and methods:
1. isolation and enrichment of intestinal epithelium
Intestinal epithelial cells crypt units, villus units and colon crypt units using chelating agents at low temperature were eluted and separated. The connection between the epithelial cells and maintain the integrity of the basement membrane for separation and collection of cell HE slice to observe. The inherent layer source of blood cells by immunofluorescence staining of CD45 pollution to identify.
Screening of 2. intestinal epithelial cell differentiation miRNA
Small intestinal villus and crypt cells were separated and enriched respectively after extraction of RNA.18 to 100nt RNA from the total RNA. After further purification of fluorescent markers, RNA and miRNA chip hybridization of small intestinal crypt and villus cells. Expression of miRNA spectrum of different gene SAM and cluster analysis.
3. verify the related results of miRNA chip
The differential expression of miRNA between 6 recess and villi cells was selected by Northern Blot.
Result:
1. obtain the high purity of the villi of small intestinal epithelium, crypt cells and colonic crypt epithelial cells. The intestinal epithelial villi, crypt cells and colonic crypt epithelial cells in position conditions were isolated and purified. The inherent layer cavity surface of basement membrane intact. I see in the epithelial cell enrichment in less expression of CD45 in cells of hematopoietic origin..
2., screening of intestinal epithelial differentiation related miRNA and comparison of crypt cells. 35 miRNA expressed differently in villous cells, of which 16 upregulated miRNA (multiple greater than 2) and 19 down regulated miRNA (multiple less than 0.7). Hierarchical clustering tree was generated by cluster software.
3. miRNA chip results using Northern blot method to verify. From the intestinal segment, colon segment, segment of small intestine to epithelium, intestinal villi cells, RNA integrity of the intestinal crypt and colonic crypt cells were well preserved. The expression of miRNA. results showed that three out of six results and chip electrophoresis and detection of the 6 selected consistent out of these differences to total RNA. Compared with the crypt cells, upregulation of villus cells miR-183, miR-31, down miR-19-b.
Conclusion:
1. we successfully established a method of separating the benign small intestinal epithelium from the colon epithelial cells.
2. we have obtained a series of miRNA candidate molecules associated with intestinal epithelial differentiation.
3. we confirmed the expression patterns of miR-143, miR-31, miR-22, miR-183, miR-17-5p, and miR-19b in the small intestine and colon

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R346

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