本文關(guān)鍵詞：皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子不對稱分布的研究　出處：《汕頭大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 以往的研究表明IL-6等細(xì)胞因子在大腦皮層和海馬呈不對稱分布。盡管腦不對稱已為人們廣泛深入的研究,但目前為止,細(xì)胞因子在皮質(zhì)的不對稱分布的細(xì)胞學(xué)來源仍然只是明確為來自神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。由于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對炎癥損傷的免疫功能在兩側(cè)大腦半球是不對稱分布的,那么,細(xì)胞因子在皮質(zhì)的不對稱分布來自何種膠質(zhì)細(xì)胞?帶著這個問題,我們研究了在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中數(shù)目最多,分布最廣,擔(dān)負(fù)了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的大部分功能的星形膠質(zhì)細(xì)胞。用LPS刺激體外培養(yǎng)的小鼠左、右側(cè)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞,分別從蛋白水平檢測其分泌IL-6、TNF-α和IL-1-β的情況,實驗分別對新生BALB/c小鼠左、右兩側(cè)大腦皮質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞分組體外培養(yǎng),LPS刺激24h,對照左、右側(cè)無LPS刺激組。結(jié)果表明,LPS刺激后的左側(cè)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的培養(yǎng)上清中IL-6水平較右側(cè)高,兩者有顯著性差別(p0.05)。并對兩側(cè)有差別的因子IL-6用RT-PCR的方法來分析mRNA的表達(dá)情況。用半定量RT-PCR檢測左、右兩側(cè)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6在基因水平上的不同。結(jié)果表明左側(cè)皮質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞的IL-6mRNA水平顯著高于右側(cè)(p0.05)。炎癥因子作用下大腦皮質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-6在蛋白和mRNA水平均有顯著性差異。關(guān)于LPS的識別受體,目前多認(rèn)為TLR4、CD14和MD-2分子三者構(gòu)成了“LPS的識別受體復(fù)合體”,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS刺激24h的小鼠左側(cè)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-6水平顯著高于右側(cè),那么左、右側(cè)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞對LPS的識別受體TLR4、CD14和MD-2分子是否也存在不對稱性呢?帶著這個問題,我們檢測了小鼠左、右側(cè)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后TLR4/ MD-2、CD14分子的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)CD14分子顯著上調(diào),右側(cè)較左側(cè)及無LPS刺激對照組有顯著升高,p0.01;而TLR4/ MD-2分子顯著下調(diào),與無LPS刺激對照組相比p0.01。此外,應(yīng)用人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1感染人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并對照LPS刺激組觀察IL-6、TNF-a、IL-1β等細(xì)胞因子的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)流感病毒和LPS刺激均可引起IL-6、TNF-a、IL-1β等炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量增強。 方法 取新生BABL/c小鼠(24 h),斷頭處死。去除腦膜,分離左、右兩側(cè)大腦皮質(zhì),制備神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。純化分離星形膠質(zhì)細(xì)胞,免疫組化鑒定。LPS刺激24h,設(shè)對照組(不加LPS刺激)。ELISA法檢測IL-6、TNF-a、IL-1的水平。應(yīng)用Trizol試劑,提取星形膠質(zhì)細(xì)胞總RNA,合成cDNA。PCR反應(yīng),產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖(AG ,agarose)凝膠電泳,在凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照和圖像分析。LPS刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞和對照組細(xì)胞分別加入FITC-Conjugated Anti-mouse CD14 2ul和PE-Conjugated Tol-like receptor 4/ MD-2,設(shè)同型對照管,流式細(xì)胞儀檢測。流感病毒H1N1、H5N1亞型感染人皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。Trizol作用后,收集至離心管中提取細(xì)胞總RNA,合成cDNA。PCR反應(yīng),PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖(AG ,agarose)凝膠電泳,在凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照和圖像分析。 結(jié)果 一、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定 1.在倒置顯微鏡下,原代培養(yǎng)9d的皮質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞,胞突豐富,分支較多而形態(tài)呈多邊形,主要包括:星形膠質(zhì)細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。培養(yǎng)過程中給予定軌搖床重復(fù)搖晃培養(yǎng)瓶,將培養(yǎng)液移至新培養(yǎng)瓶中,10-20min小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁,棄上清,繼續(xù)培養(yǎng)。第20d的皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞,在倒置顯微鏡下可見多數(shù)胞體呈星形,核大呈圓形或橢圓形,由胞體伸出許多呈放射狀走行的突起形態(tài)。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:細(xì)胞爬片上,凡胞漿被DAB染上棕黃色的細(xì)胞均為星形膠質(zhì)細(xì)胞。隨機對5個顯微鏡視野中細(xì)胞計數(shù),發(fā)現(xiàn)98%以上的細(xì)胞胞漿GFAP蛋白表達(dá)陽性,而陰性對照片中,成纖維細(xì)胞的胞漿無此著色。表明經(jīng)差速貼壁30min可以很好地去除成纖維細(xì)胞;給予定軌搖床重復(fù)搖晃培養(yǎng)瓶,可得到純度很高的星形膠質(zhì)細(xì)胞 二、LPS對左、右兩側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6含量的影響 LPS作用24h后,左、右兩側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的含量明顯升高,與對照組相比差異具有顯著性(p0.05);左側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6顯著高于右側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞(p0.05);左、右兩側(cè)對照組相比,差異無顯著性(p0.05)。兩側(cè)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的TNF-a較無LPS刺激的對照組有顯著升高,左側(cè)實驗組高于左側(cè)對照組,p0.01;右側(cè)實驗組高于右側(cè)對照組,p0.05。左側(cè)和右側(cè)實驗組未見顯著差別,p0.05。LPS刺激6h和24h的情況下,星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-1在實驗組較對照組均有較大提高,但左側(cè)和右側(cè)實驗組及對照組均無顯著性差別,p0.05。 三、LPS對左右兩側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)水平的影響 以IL-6和β-actin光密度值的百分比來反映各組IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。RT-PCR結(jié)果顯示:與control組相比,LPS刺激的左側(cè)組及右側(cè)組培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)水平明顯增高(p0.05),左側(cè)組顯著高于右側(cè)組(p0.05)。 四、TLR4/MD-2在兩側(cè)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá) 無LPS刺激的對照組TLR4/MD-2的陽性細(xì)胞率較低,LPS刺激可下調(diào)表達(dá)TLR4/MD-2的陽性細(xì)胞率,兩側(cè)實驗組陽性細(xì)胞率均下降,與無LPS刺激對照組相比p0.01,兩側(cè)實驗組膜受體TLR4/MD-2的下調(diào)無差別p=0.792。 五、CD14在兩側(cè)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá) LPS刺激右側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞C14陽性細(xì)胞率較左側(cè)及對照組有顯著升高,p0.01。表明LPS可上調(diào)膜受體CD14在皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá),右側(cè)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞較左側(cè)對LPS的刺激有更高的敏感性。 六、流感病毒H1N1和H5N1亞型感染人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 LPS誘導(dǎo)和人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1亞型感染人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,均可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-a和IL-1βmRNA的表達(dá)量增強。 結(jié)論 1.經(jīng)差速貼壁30min可以很好地減少成纖維細(xì)胞的生長;小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入少量星形膠質(zhì)細(xì)胞后可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的生長、分化;給予定軌搖床重復(fù)搖晃培養(yǎng)瓶,可得到純度較高的星形膠質(zhì)細(xì)胞。 2. LPS誘導(dǎo)24h,左側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-6水平顯著高于右側(cè)。左、右側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-a均顯著高于無LPS誘導(dǎo)組,但左、右側(cè)無差別。釋放IL-1β的含量也較無LPS誘導(dǎo)組明顯升高,但無統(tǒng)計學(xué)意義,左、右側(cè)無差別。 3. LPS誘導(dǎo)的左側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著高于右側(cè)。 4.無LPS誘導(dǎo)的新生小鼠左、右側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞在蛋白和mRNA水平均表達(dá)較低水平的IL-6。 5. LPS誘導(dǎo),可下調(diào)TLR4/MD-2在皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá);右側(cè)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的膜受體CD14水平上調(diào)顯著高于左側(cè)。 6. LPS誘導(dǎo)、人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1亞型感染人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,均可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-a和IL-1β的mRNA表達(dá)量增強。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：1379427