本文關(guān)鍵詞：維生素D受體調(diào)控尿鈣重吸收的分子機制研究　出處：《華中科技大學》2010年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 第一部分 靶向大鼠維生素D受體基因miRNA重組腺病毒載體的構(gòu)建及腺病毒的制備 目的：設計、篩選能有效抑制大鼠維生素D受體(VDR)基因表達的miRNA序列,并將miRNA序列與腺病毒載體重組,制備能表達VDR-miRNA的腺病毒。 方法：根據(jù)大鼠VDR基因序列設計并合成4對miRNA oligo序列(SR-63-1-SR-63-4),退火成雙鏈,將其分別插入到miRNA表達載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR中,構(gòu)建4個miRNA表達質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α。用載體通用引物進行菌落PCR篩選,篩選得到的陽性克隆進行測序,以驗證重組克隆中插入片段序列是否與設計的oligo序列一致。將大鼠PC-12細胞VDR克隆至pcDNA3.1質(zhì)粒構(gòu)建VDR高表達載體,VDR高表達載體和miRNA干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細胞,Real time q-PCR和Western Blot分別檢測共轉(zhuǎn)染干擾效果。將構(gòu)建成功的靶向大鼠VDR基因的干擾效率最高的miRNA干擾質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-VDR-miR,通過BP/LR反應,將EmGFP-VDR-miR表達框整合重組到腺病毒載體pAD/CMV/V5-DEST上,測序鑒定。重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細胞,包裝收集并檢測腺病毒滴度。 結(jié)果：測序證實pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR干擾質(zhì)粒中插入了設計的miRNA序列。與NCBI序列比對,pcDNA3.1高表達質(zhì)粒中插入了大鼠VDR基因序列。Real time q-PCR和Western Blot證實3號干擾質(zhì)粒(SR-63-3-1)對VDR基因的干擾效果最為明顯,在轉(zhuǎn)錄水平基因抑制效率達83%。經(jīng)測序鑒定證實,成功構(gòu)建了靶向大鼠VDR基因的miRNA腺病毒載體pAD/CMV/V5-GW/EmGFP-VDR-miR,平均滴度為1.44×1011ifu/ml,陰性對照病毒pAd-GFP的平均滴度為7.56×1010ifu/ml。 結(jié)論：成功構(gòu)建能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平有效抑制大鼠VDR基因表達的miRNA腺病毒干擾載體,并制備了高滴度的腺病毒。 第二部分 腺病毒載體介導維生素D受體基因RNAi對正常大鼠腎上皮細胞鈣轉(zhuǎn)運蛋白表達和細胞內(nèi)游離鈣濃度的影響 目的：研究維生素D受體(VDR)對正常大鼠腎上皮細胞鈣轉(zhuǎn)運蛋白表達的調(diào)控作用及對細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響,以了解VDR在特發(fā)性高鈣尿癥發(fā)生中的作用及其機制。 方法：利用構(gòu)建靶向VDR基因RNA干擾的腺病毒載體,轉(zhuǎn)染正常大鼠腎小管上皮細胞(NRK),于轉(zhuǎn)染后48h,72h,96h和120h收集細胞,提取細胞總RNA和蛋白質(zhì),使用real time q-PCR和western blot法分別檢測干擾前后不同時間點VDR及編碼上皮鈣轉(zhuǎn)運蛋白基因mRNA和蛋白的表達水平；應用Ca2+熒光探針標記NRK細胞胞漿內(nèi)游離Ca2+,激光掃描共聚焦顯微鏡檢測干擾前后不同時間點細胞胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染48h后,NRK細胞VDR mRNA和蛋白表達水平開始下降,96h達最低值,與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),而NRK細胞上皮鈣轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白瞬時感受電位通道V5 (TRPV5)、鈣結(jié)合蛋白28kd (Calbindin-D28k)和細胞膜鈣泵1b (PMCA1b)的mRNA和蛋白表達水平在轉(zhuǎn)染48h后開始下降,72h后與對照組比較差異達統(tǒng)計學意義(P0.05),96h達最低值。而瞬時感受電位通道V6 (TRPV6)和鈉鈣交換子1 (NCX1) mRNA和蛋白表達水平在VDR干擾前后不同時間點差異均無統(tǒng)計學意義；同時,抑制NRK細胞VDR基因的表達48h后,胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度開始下降,96h降至最低,與基線水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),120h后胞漿內(nèi)鈣離子濃度恢復正常。 結(jié)論：維生素D受體可正性調(diào)控正常大鼠腎小管上皮細胞鈣轉(zhuǎn)運蛋白TRPV5、Calbindin-D28k和PMCAlb基因的表達,對TRPV6和NCX1基因的表達無明顯調(diào)控作用,抑制VDR基因的表達可導致NRK細胞胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度降低。然而,VDR基因的異常表達在特發(fā)性高鈣尿癥發(fā)生中的作用及機制仍需進一步研究。 第三部分 體內(nèi)干擾大鼠腎臟維生素D受體基因的表達對大鼠腎組織鈣轉(zhuǎn)運蛋白表達及尿鈣排泄的影響 目的：應用遺傳高鈣尿結(jié)石形成(GHS)大鼠模型,研究腎臟維生素D受體(VDR)異常表達與GHS大鼠尿鈣重吸收障礙的相關(guān)性,以及發(fā)生的分子機制。 方法：選取培育的第18代GHS大鼠和正常尿鈣SD(NC)大鼠各24只,隨機分為6組,平均每組4只。第1-4組采用外科手術(shù)方法經(jīng)腎靜脈每側(cè)腎臟分別注入2.5×1010ifu VDR-miRNA干擾腺病毒載體,第5組注入相同劑量的陰性病毒載體作為陰性對照,第6組注入相同體積的生理鹽水作為空白對照。第1-4組分別于注入病毒后3、7、14和21天麻醉下取出雙腎并處死大鼠,陰性對照組和空白對照組于注射后14天取出雙腎并處死大鼠,處死大鼠前2天連續(xù)收集2個24小時尿液標本,取腎標本同時留取血清標本。腎組織制作冰凍切片,熒光顯微鏡觀察腎小管上皮病毒感染效率。Real-time q-PCR法和western blot法分別檢測腎組織VDR、鈣敏感受體(CaSR)和編碼上皮鈣轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白基因的mRNA和蛋白表達水平,后者包括瞬時感受電位通道V5 (TRPV5)、瞬時感受電位通道V6 (TRPV6)、鈣結(jié)合蛋白9kd (Calbindin-D9k)、鈣結(jié)合蛋白28kd(Calbindin-D28k)、鈉鈣交換子1(NCX1)和細胞膜鈣泵1b(PMCA1b)。檢測尿鈣濃度及血清鈣、磷、甲狀旁腺激素和1,25(OH)2D3水平。 結(jié)果：GHS大鼠腎組織VDR、Calbindin-D28k和CaSR表達的基礎水平比NC大鼠高,而TRPV5、TRPV6、Calbindin-D9k和PMCAlb表達的基礎水平比NC大鼠低,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。熒光顯微鏡觀察腺病毒載體成功感染GHS和NC大鼠腎小管上皮細胞,注入VDR-miR RNAi病毒載體后第3天,GHS大鼠腎組織VDR mRNA和蛋白的表達水平較空白對照組和陰性對照組顯著降低(P0.01), VDR基因表達水平在RNAi后第21天達最低值(P0.01),表明腎組織VDR基因干擾成功,而NC大鼠干擾后VDR的表達水平無顯著下降,與空白對照組和陰性對照組比較差異未達統(tǒng)計學意義(P0.05)。GHS大鼠腎組織VDR基因敲減后導致組織TRPV5、Calbindin-D9k和NCX1基因表達上調(diào),對CaSR和其它上皮鈣轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達調(diào)控作用不明顯,而NC大鼠腎組織VDR基因敲減對上述各基因的表達無明顯影響。GHS大鼠腎組織VDR基因敲減后第7-21天,24小時尿鈣排泄量較干擾前顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),NC大鼠24小時尿鈣排泄量較干擾前輕微增加,差異未達統(tǒng)計學意義(P0.05),空白對照組和陰性對照組GHS和NC大鼠24小時尿鈣排泄量較干預前輕微增加,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。腎組織VDR基因敲減后對血清鈣、磷、甲狀旁腺激素和1,25(OH)2D3水平無明顯影響。 結(jié)論：GHS大鼠腎組織VDR基礎水平顯著高于NC大鼠,而TRPV5基礎水平顯著低于NC大鼠。GHS大鼠腎臟尿鈣重吸收減少可能與腎組織TRPV5基礎表達水平下降相關(guān),并且這一過程受VDR調(diào)控。腎組織VDR基因的異常表達可能是GHS大鼠產(chǎn)生高鈣尿的機制之一。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R334

【共引文獻】

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本文編號：1353117