本文關(guān)鍵詞：人C5a受體與金黃色葡萄球菌分泌趨化抑制蛋白的相互作用以及翻譯后酪氨酸硫化修飾的重要意義　出處：《中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的：探討金黃色葡萄球菌分泌的趨化抑制蛋白(CHIPs)與趨化因子C5a受體(C5aR)或促�；鞍资荏w(C5L2)的相互作用及C5aR氨基末端酪氨酸硫化修飾對(duì)其與CHIPs結(jié)合能力的影響。 方法： 1.提取耐甲氧西林金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213的基因組DNA,設(shè)計(jì)引物體外擴(kuò)增趨化抑制蛋白編碼基因chp,重組CHIPs表達(dá)載體,原核表達(dá)并純化CHIPs蛋白,測(cè)定純化樣品的濃度。 2.外周血提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄,設(shè)計(jì)引物體外擴(kuò)增C3aR, C5aR, C5L2, CXCR3和PTAFR,分別表達(dá)于HEK 293T細(xì)胞上并通過(guò)western blot進(jìn)行鑒定。 3.將純化的CHIPs蛋白分別與表達(dá)C3aR,C5aR,C5L2,CXCR3或PTAFR的HEK293T孵育,通過(guò)Western blot方法檢測(cè)其結(jié)合能力。 4.非特異性硫化抑制劑NaClO3干預(yù)表達(dá)C5aR的HEK 293T細(xì)胞,檢測(cè)不同濃度的NaCl03對(duì)C5aR與CHIPs結(jié)合能力的影響；比較了TPST或shRNA共轉(zhuǎn)染的C5aR與CHIPs蛋白親和能力的變化；將C5aR氨基末端第11位或(和)第14位的酪氨酸突變成苯丙氨酸,證實(shí)這兩個(gè)位點(diǎn)的酪氨酸硫化修飾對(duì)C5aR與CHIPs親和能力的重要性。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了重組CHIPs和多種趨化因子受體表達(dá)載體,得到純度較高的CHIPs蛋白樣品,濃度為96μg/ml,并將C3aR, C5aR, C5L2, CXCR3和PTAFR分別表達(dá)在HEK 293T細(xì)胞上。通過(guò)western blot方法測(cè)定CHIPs蛋白與C5aR相結(jié)合,與C3aR, C5L2, CXCR3和PTAFR無(wú)明顯結(jié)合信號(hào)。NaC103對(duì)C5aR與CHIPs結(jié)合能力的影響具有濃度依賴(lài)性；當(dāng)NaCl03終濃度達(dá)到50mmol/L時(shí),C5aR與CHIPs結(jié)合能力較對(duì)照組減弱76.47%；與TPST共轉(zhuǎn)染的C5aR與CHIPs結(jié)合能力增強(qiáng)2.3倍,而與shRNA共轉(zhuǎn)染的C5aR與CHIPS的結(jié)合能力未見(jiàn)顯著減弱；當(dāng)C5aR的N端第14位的酪氨酸突變成苯丙氨酸時(shí),C5aR與CHIPs的親和能力較野生型下降76.32%,而當(dāng)C5aR的N端第11位和第14位的酪氨酸都突變成苯丙氨酸時(shí),C5aR與CHIPs幾乎不存在結(jié)合。 結(jié)論：人C5aR,非C5L2,是CHIPs蛋白的天然受體。研究證實(shí)C5aR的N端第14位的酪氨酸硫化修飾對(duì)于C5aR與配基的結(jié)合具有非常重要的作用。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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1 高金明,林耀廣;趨化因子及其受體與氣道疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2004年04期

2 高金明;趨化因子CXC受體3在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中的作用[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2005年01期

3 高金明;補(bǔ)體3a受體第2胞外上174位硫化酪氨酸形成其配基結(jié)合位點(diǎn)[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2004年03期

4 高金明;馮起平;左瑾;方福德;蔣磊;郭子健;;酪氨酸硫化修飾對(duì)酪氨酸硫化轉(zhuǎn)移酶活性的調(diào)節(jié)[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2007年02期

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本文編號(hào)：1350447