本文關(guān)鍵詞：微創(chuàng)大鼠體外循環(huán)模型的建立及PPAR激動(dòng)劑對(duì)體外循環(huán)腎損傷的保護(hù)　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2008年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】： 雖然體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass,CPB)技術(shù)取得長(zhǎng)足進(jìn)步,但因?yàn)榻邮荛_(kāi)胸心臟手術(shù)的患者數(shù)量及手術(shù)難度均呈增加趨勢(shì),并且越來(lái)越多的老年以及有合并癥的患者接受手術(shù),體外循環(huán)后臟器功能損傷仍廣泛存在。對(duì)體外循環(huán)損傷機(jī)制及器官保護(hù)的研究也越來(lái)越多,大量的體外循環(huán)臨床前研究需要簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可靠的動(dòng)物模型。大動(dòng)物模型雖然能比較完整地復(fù)制臨床體外循環(huán)過(guò)程,但操作比較復(fù)雜且實(shí)驗(yàn)花費(fèi)高昂。本實(shí)驗(yàn)在我們既往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行多方面的改進(jìn),建立起一個(gè)微創(chuàng)大鼠體外循環(huán)模型,并研究了在特定體外循環(huán)條件下大鼠腎損傷特點(diǎn)以及可能的機(jī)制,探討該動(dòng)物模型是否可以作為研究體外循環(huán)后腎臟損傷的可靠模型。 過(guò)氧化物酶增殖體激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)屬核受體超家族成員,分α、β和γ三種亞型。PPAR激活在生理病理狀態(tài)下具有多種作用,如調(diào)節(jié)糖、脂肪代謝,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、惡性腫瘤的形成;具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫和抗增殖活性的作用等。既往的研究證實(shí),PPAR激動(dòng)劑能保護(hù)糖尿病、高血壓及其他多種疾病導(dǎo)致的慢性腎功能損傷,另外在缺血再灌注、腎毒性藥物等多個(gè)腎損傷動(dòng)物模型中亦體現(xiàn)出腎功能保護(hù)作用。PPAR激動(dòng)劑可以減少體外循環(huán)所致的心肌細(xì)胞凋亡并保護(hù)心功能,但PPAR激動(dòng)劑在體外循環(huán)后腎功能損傷方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。我們通過(guò)喂飼大鼠PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮后行體外循環(huán)實(shí)驗(yàn),以明確PPAR激動(dòng)劑在大鼠體外循環(huán)模型中是否具有腎臟保護(hù)作用,并探討可能的機(jī)理。 第一部分微創(chuàng)大鼠體外循環(huán)模型的建立及其腎損傷 目的 建立微創(chuàng)大鼠體外循環(huán)模型,研究在特定體外循環(huán)條件下大鼠腎損傷特點(diǎn)以及可能的機(jī)制,探討該動(dòng)物模型是否可以作為研究體外循環(huán)后腎臟損傷的可靠模型。 材料和方法 成年SD大鼠80只,每組10只隨機(jī)分入8組,分別為:假手術(shù)組、CPB結(jié)束時(shí)、CPB后2小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和96小時(shí)。CPB大鼠麻醉后穿刺左側(cè)股動(dòng)脈、右側(cè)頸外靜脈和尾動(dòng)脈分別用于動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)、靜脈引流和動(dòng)脈灌注,連接各預(yù)充的體外循環(huán)管路接受60分鐘體外循環(huán),最大流量100ml/Kg/min。假手術(shù)組麻醉插管,但不實(shí)施CPB。監(jiān)測(cè)CPB前后大鼠血壓、心率、體溫、血?dú)�、酸堿電解質(zhì)。按不同分組在各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,剖腹經(jīng)腹主動(dòng)脈采血1.5ml,直視下膀胱穿刺抽取尿液1～1.5ml,取雙側(cè)。腎臟,一側(cè)以10%甲醛溶液固定行組織學(xué)檢查,另一側(cè)置于液氮中保存用以檢測(cè)蛋白含量。從血清肌酐、尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)性脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin,NGAL)和腎臟組織形態(tài)學(xué)變化等三方面評(píng)價(jià)各組大鼠腎功能損傷,檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、組織TNF-α、核因子-κB(NF-κB)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化歧化酶(SOD)、還原性谷胱甘肽(GSH),評(píng)價(jià)大鼠全身和腎臟組織炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激。以SPSS 13.00行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,p＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 所有大鼠順利完成插管及體外循環(huán),均存活至設(shè)定的實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。在體外循環(huán)中大鼠血壓、心率、體溫、紅細(xì)胞比容、動(dòng)脈血氧分壓PaO2和pH值較體外循環(huán)前顯著改變,體外循環(huán)結(jié)束后各生理數(shù)據(jù)逐步恢復(fù),但術(shù)后2小時(shí)包括血壓、心率、體溫、紅細(xì)胞比容和pH等仍較術(shù)前基礎(chǔ)值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)歷體外循環(huán)后,大鼠腎功能受損,血清肌酐值升高,在術(shù)后12小時(shí)與術(shù)前值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,48小時(shí)達(dá)到峰值;尿NGAL在術(shù)后2小時(shí)即顯著上升,術(shù)后12小時(shí)達(dá)到峰值。體外循環(huán)后,大鼠近曲小管上皮變性,有灶性脫落,上皮細(xì)胞腫脹或空泡變性,大部分小管刷狀緣消失,遠(yuǎn)曲小管形態(tài)尚好,可見(jiàn)蛋白管型和白細(xì)胞浸潤(rùn)以及凋亡。 體外循環(huán)后大鼠血清TNF-α明顯高于假手術(shù)組,同時(shí)反映炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平的腎組織內(nèi)TNF-α、NF-κB、MPO、MDA表達(dá)增高,大多在體外循環(huán)后6～24內(nèi)達(dá)到高峰。相對(duì)應(yīng)的反映組織還原性的CAT、SOD、MDA則均在體外循環(huán)后均下降,而在體外循環(huán)后48小時(shí)開(kāi)始恢復(fù),但至實(shí)驗(yàn)結(jié)束亦未能恢復(fù)至術(shù)前值。 結(jié)論 1、本研究建立的微創(chuàng)大鼠體外循環(huán)模型具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、微創(chuàng)、體外循環(huán)參數(shù)設(shè)置接近臨床、成功率高、生存期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。可以作為部分研究體外循環(huán)實(shí)驗(yàn)的可靠的動(dòng)物模型。 2、在設(shè)定的體外循環(huán)條件下大鼠出現(xiàn)腎功能損傷,該損傷是可以自行恢復(fù)的。 3、體外循環(huán)后大鼠出現(xiàn)全身和腎臟組織局部的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,可能在腎功能損傷過(guò)程中起到一定作用。 4、相對(duì)于血清肌酐,尿NGAL是一個(gè)更早期、敏感、特異的腎臟損傷標(biāo)志。 第二部分PPAR-γ激動(dòng)劑對(duì)體外循環(huán)大鼠腎臟保護(hù)作用及機(jī)理研究 目的 應(yīng)用第一部分建立的動(dòng)物模型,研究PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮對(duì)體外循環(huán)所致大鼠腎功能損傷是否具有保護(hù)作用,并探討可能機(jī)制。 材料和方法 成年SD大鼠30只,每組10只隨機(jī)分入3組:假手術(shù)組、對(duì)照組和PPAR組。術(shù)前1周起,大鼠連續(xù)7天用灌胃針經(jīng)口按20mg/kg體重劑量給予吡格列酮溶液,假手術(shù)組和對(duì)照組經(jīng)灌胃針給予生理鹽水2ml。對(duì)照組和PPAR組麻醉插管后接受60分鐘體外循環(huán),最大流量100ml/Kg/min。假手術(shù)組行類(lèi)似操作,但不實(shí)施體外循環(huán)。實(shí)驗(yàn)前后監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓、心率、體溫、紅細(xì)胞比容和氧分壓。于肝素化后轉(zhuǎn)流前(T1)、轉(zhuǎn)流結(jié)束后(T2)、術(shù)后2小時(shí)(T3)以及術(shù)后12小時(shí)(T4)采集血液標(biāo)本,檢測(cè)血清肌酐和TNF-α;于術(shù)后12小時(shí)將大鼠處死,剖腹經(jīng)腹主動(dòng)脈采血1.5ml,直視下膀胱穿刺抽取尿液1～1.5ml,取雙側(cè)腎臟,一側(cè)以10%甲醛溶液固定行組織學(xué)檢查,另一側(cè)置于液氮中保存用以檢測(cè)蛋白含量。從血清肌酐、尿NGAL和腎臟組織形態(tài)學(xué)變化等三方面評(píng)價(jià)三組大鼠腎功能損傷程度。PPAR-γ活化以免疫組化方法檢測(cè)。檢測(cè)血清TNF-α、組織TNF-α、NF-κB、MPO、MDA、CAT、SOD、GSH,評(píng)價(jià)三組大鼠全身和腎臟組織炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激水平。以SPSS 13.00行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,p＜0.05為差異顯著。 結(jié)果 所有大鼠順利接受手術(shù),存活至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。接受體外循環(huán)的大鼠手術(shù)過(guò)程中的血壓、心率、體溫、紅細(xì)胞比容、氧分壓和pH值與假手術(shù)組相比均有顯著差異,而對(duì)照組和PPAR組之間上述指標(biāo)無(wú)顯著差異。對(duì)照組和PPAR組血清肌酐值在手術(shù)結(jié)束和手術(shù)后2小時(shí)顯著低于假手術(shù)組;術(shù)后12小時(shí)時(shí)三者肌酐值對(duì)照組＞PPAR組＞假手術(shù)組,但三者差異卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組和PPAR組術(shù)后12小時(shí)尿NGAL水平均顯著高于假手術(shù)組,但PPAR組顯著低于對(duì)照組。相比于假手術(shù)組,對(duì)照組和PPAR組均表現(xiàn)出一定程度的組織學(xué)損傷,PPAR組的腎組織損傷評(píng)分和凋亡系數(shù)均顯著低于對(duì)照組。 體外循環(huán)后對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α顯著高于假手術(shù)組,PPAR組血清TNF-α值雖高于假手術(shù)組,卻顯著低于對(duì)照組。經(jīng)歷體外循環(huán)后腎組織中炎癥反應(yīng)的指標(biāo)如TNF-α、NF-κB、MPO以及氧化應(yīng)激的指標(biāo)MDA,在對(duì)照組普遍升高,在PPAR組中雖也升高卻顯著低于對(duì)照組升高幅度;而組織中還原型物質(zhì)在PPAR組卻顯著高于對(duì)照組。顯示PPAR可以減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平。 結(jié)論 1、大鼠經(jīng)歷體外循環(huán)后發(fā)生腎功能損傷,全身和腎臟組織中出現(xiàn)炎癥反應(yīng)激活和氧化應(yīng)激。 2、PPAR激動(dòng)劑吡格列酮具有減輕體外循環(huán)所致腎功能損傷的作用。 3、吡格列酮保護(hù)腎功能的作用可能部分與其減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)。
[Abstract]:Although the CPB (cardiopulmonary bypass CPB) technology has made great progress, but because of an open heart surgery patients and the number of operation difficulty increased, and more and more elderly and complications of patients after cardiopulmonary bypass surgery, organ damage still exists. There are more and more researches on the injury mechanism and organ protection of cardiopulmonary bypass. A large number of extracorporeal circulation preclinical studies need simple, economic and reliable animal models. Although the large animal model can reproduce the process of clinical cardiopulmonary bypass in a relatively complete way, the operation is complicated and the experiment is expensive. In this experiment, many improvements based on our previous research, establish a cycle model of minimally invasive rats in vitro were studied, in particular under extracorporeal circulation of rat renal injury characteristics and possible mechanism of the animal model can be used as a reliable model of renal injury after cardiopulmonary bypass.
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R654.2;R-332

【共引文獻(xiàn)】

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