本文關鍵詞：人胚胎干細胞生物學性狀及向內(nèi)皮分化過程中ID-1基因作用的研究　出處：《山東大學》2010年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 人胚胎干細胞 原核 合子 多能性 人胚胎干細胞 分化 內(nèi)皮細胞 轉(zhuǎn)化生長因子-beta1 分化抑制子/DNA結合抑制子-1 血管發(fā)生

【摘要】： 第一部分由正常和異常原核來源的合子得到的人胚胎干細胞系生物性狀的比較 目的：人胚胎干細胞系可建立于正常和異常受精的合子,然而,這兩種類型的人胚胎干細胞系之間的性狀的異同尚未可知。有文獻報道雙倍體的人胚胎干細胞系可以由單原核來源的合子建系得到,但形態(tài)學為多原核受精的合子是否也可建立正常的人胚胎干細胞系尚無明確報道。為了探索這些問題,我們建立了9株人胚胎干細胞系,分別來源于形態(tài)學正常(雙原核,2PN)和形態(tài)學異常(未見原核,0PN單原核,1PN；三原核,3PN)原核的合子。通過深入比較其性狀異同,以期解決以上問題。 方法：建立來源于形態(tài)學正常和異常原核的受精合子的hES細胞系及其培養(yǎng)維持。堿性磷酸酶染色及免疫熒光染色檢測各株細胞的“干”性,畸胎瘤形成實驗檢測體內(nèi)分化能力,RT-PCR分析檢測體外分化能力。核型分析檢測各株細胞的遺傳穩(wěn)定性,DNA質(zhì)譜分析檢測每株hES細胞的基因組DNA的特異性。流式細胞術分析細胞周期分布情況,BrdU摻入實驗分析細胞系增殖潛力。實時定量PCR分析代表分化及未分化基因的表達水平。hES細胞的神經(jīng)定向誘導分化檢測神經(jīng)分化潛能。 結果：我們由46個臨床廢棄的新鮮囊胚建立了9株人胚胎干細胞系(細胞株mSDU-hES 1-9),其中5個為2PN來源,2個為0PN來源,1個為1PN來源,1個為3PN來源。由形態(tài)學不同原核來源的合子得到的干細胞系顯示相似的克隆形態(tài),每株細胞系均能成功凍融,均不存在增殖及自我更新障礙。每一株胚胎干細胞系均能表達堿性磷酸酶活性及“干性”標記：OCT-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60和TRA-1-81。每隔6個月進行一次的核型分析表明,每一株胚胎干細胞系具有正常的雙倍體核型,染色體畸變未檢測到,每株胚胎干細胞系都有各自獨特的遺傳特異性標記。嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠在接種各株未分化hES細胞10-12周后經(jīng)解剖證實均有含有三個胚層細胞系的畸胎瘤形成,說明各株干細胞均具有體內(nèi)分化的全能性。細胞株mSDU-hES 1-8分化得到的擬胚體能夠表達OCT4以及代表外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的組織特異性基因,但是細胞株mSDU-hES 9 (2PN)分化得到的擬胚體僅表達代表外胚層和中胚層的基因,而并不表達代表內(nèi)胚層的基因。hES細胞系的細胞周期分布呈獨特的4階段細胞周期模式,特征為大量細胞處于S期而小部分細胞處于Go／G1和G2／M期。與細胞株mSDU-hES 5(2PN)比較,細胞株mSDU-hES 2(0PN)顯示有更多的細胞處于S期,具有較高含量的增殖期細胞；而1PN和3PN合子來源的hES細胞系與細胞株mSDU-hES 5(2PN)具有相似的增殖期細胞含量。mSDU-hES 2 (OPN)比其它細胞株具有較短的細胞周期和較高的增殖率。所檢測的所有細胞系均可表達11種分化及未分化標記,但其基因表達含量各不相同。對于大多數(shù)未分化的基因OCT4, NANOG, LIN41和SOX2,各株細胞系間無明顯差異。然而,2PN來源的細胞株mSDU-hES5中DPPA5的表達顯著低于其它細胞系,而3PN來源的mSDU-hES8中UTF1的表達顯著高于其它細胞系。各株細胞系對于分化基因的表達也存在較大的差異。這種分化及未分化標記基因相對含量表達差異在正常的hES細胞株之間同樣存在。hES細胞經(jīng)過3周神經(jīng)定向分化的培養(yǎng),來源于形態(tài)學正常及異常受精合子的干細胞株均可分化出NESTIN陽性神經(jīng)前體細胞和TUJ1陽性神經(jīng)元細胞,且2PN合子來源的hES細胞株及0PN、1PN、3PN合子來源的hES細胞株具有相似神經(jīng)分化潛能。 結論：1.來源于形態(tài)學上不同原核的合子的9株hES細胞系具有相似的大致特征。所有9株細胞表達相似的“干性”標記,包括轉(zhuǎn)錄因子及糖脂分子標記物：OCT-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60及TRA-1-81；各株細胞的增殖能力及在擬胚體和畸胎瘤中分化為外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞系的潛能也具有相似性。在神經(jīng)定向分化條件下,所有的細胞株均可分化成神經(jīng)前體和神經(jīng)元。2.在細胞周期和分化及未分化標記基因的相對表達量等方面存在差異。這些差異在正常來源的不同人胚胎干細胞系之間也同樣存在。這種現(xiàn)象可能決定于不同細胞系本身的生物學特性,而非與形態(tài)學正�；虍惓Ｔ藖碓聪嚓P。3.正常的人胚胎干細胞系可以由臨床棄用的具有形態(tài)學異常原核的受精合子建立。 第二部分ID-1基因在TGF-betal誘導的人胚胎干細胞定向分化為血管內(nèi)皮細胞中的作用探討 目的：分化抑制子／DNA結合抑制子-1(ID-1)是內(nèi)皮細胞(ECs)中活化素受體樣激酶-1(ALK1)的特異性下游基因,它介導轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)／ALK1誘導的(Smad依賴的)內(nèi)皮細胞遷移。然而,ID-1基因在TGF-β1誘導的人胚胎干細胞向內(nèi)皮分化及血管發(fā)生的信號轉(zhuǎn)導通路中的作用,尚未有確切的研究報道。本文以人胚胎干細胞(hESCs)的體外分化作為血管內(nèi)皮發(fā)育的模型,來研究ID-1基因在TGF-β1誘導的人胚胎干細胞定向分化為血管內(nèi)皮細胞及血管發(fā)生的信號轉(zhuǎn)導通路中的作用。 方法：建立TGF-β1誘導的人胚胎干細胞分化為血管內(nèi)皮細胞及形成血管樣結構的模型,用免疫熒光定性分析不同濃度的TGF-β1對血管內(nèi)皮定向分化及血管發(fā)生的作用。利用實時定量PCR技術檢測TGF-β1誘導組及對照組中ID-1基因和內(nèi)皮細胞標志基因PECAM, KDR的表達含量,分析TGF-β1對ID-1基因表達的影響。利用實時定量PCR技術分析TGF-β1誘導的細胞分化和血管發(fā)生過程中ID-1基因表達的時間動力學表現(xiàn)。通過小干擾RNA技術和實時定量PCR技術分析ID-1基因在TGF-β1誘導的人胚胎干細胞分化的血管內(nèi)皮細胞中的功能。利用實時定量PCR技術和western雜交技術分析分化和血管發(fā)生過程中TGF-β1受體及信號分子蛋白表達的時間動力學表達。 結果：我們發(fā)現(xiàn)在hESCs分化為ECs早期,TGF-β1能夠通過抑制ID-1基因的表達誘導人胚胎干細胞向內(nèi)皮系的定向分化,在分化晚期的血管發(fā)生階段,TGF-β1通過ALK1／Smadl,5／ID-1信號轉(zhuǎn)導通路增強ID-1基因的表達而促進內(nèi)皮細胞增殖。但是TGF-β1在血管生成過程中對于血管出芽卻起抑制作用。另外,TGF-β1誘導的人胚胎干細胞定向分化為血管內(nèi)皮細胞過程及ID-1基因的表達對于TGF-β1不僅具有時間依賴性,而且具有濃度的依賴性。通過沉默ID-1基因來降調(diào)該基因的表達將促進TGF-β1誘導的人胚胎干細胞定向分化為血管內(nèi)皮細胞而抑制分化的內(nèi)皮細胞增殖和遷移。 結論：運用TGF-β1誘導的人胚胎干細胞分化模型,我們分析了在向內(nèi)皮系分化及分化的內(nèi)皮細胞增殖過程中ID-1基因的功能。我們的數(shù)據(jù)表明,在分化過程中TGF-β1可以通過ALK5通路刺激內(nèi)皮方向的分化,而在增殖過程中則通過TGF-β1/ALK1/ID-1,Smad1/Smad5依賴的信號轉(zhuǎn)導途徑增強分化的內(nèi)皮細胞的增殖。本研究運用人胚胎干細胞體外分化的模型,有助于我們了解胚胎發(fā)育早期階段體內(nèi)血管形成的部分機制。通過進一步研究該基因的調(diào)控因子,以促進或抑制其表達水平,對于臨床治療病理性血管生成和促進修復性血管生成有指導借鑒意義。
[Abstract]:Part 1 Comparison of the biological traits of human embryonic stem cell lines obtained from the zygote of normal and abnormal prokaryotic sources
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【共引文獻】

相關期刊論文 前3條

1 王晶;李亞里;閆志風;彭紅梅;楊怡卓;;人胚胎干細胞的保存方法[J];中國組織工程研究與臨床康復;2008年12期

2 周睿卿;龔玉萍;邢宏運;楊曦;;人胚胎干細胞Pten基因表達及PI3K/Akt/mTOR信號通路下游蛋白的磷酸化[J];中國組織工程研究與臨床康復;2011年49期

3 韓寶生,樊桂玲,雷金梅,李宜學,姚新芳,劉冬婷;改良卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術在男性不育中的應用[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2003年S2期

相關博士學位論文 前2條

1 王晶;人類胚胎干細胞誘導分化為多巴胺能神經(jīng)元的實驗研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2008年

2 廖宏慶;人類不同原核數(shù)目受精卵中篩選正常優(yōu)質(zhì)胚胎的策略研究[D];中南大學;2010年

相關碩士學位論文 前2條

1 孫小閔;人皮膚成纖維細胞攪拌培養(yǎng)和保存的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學;2010年

2 莊淑波;大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞與PLGA構建組織工程脂肪的實驗研究[D];蘭州大學;2007年

，

本文編號：1341188