本文關(guān)鍵詞：TLR4和核仁素受體介導(dǎo)呼吸道合胞病毒感染中樞神經(jīng)元的初步研究　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)為副粘病毒科肺炎病毒屬,是有包膜非節(jié)段性的單股負(fù)鏈RNA病毒,同時(shí)也是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒下呼吸道感染的最主要病原,在嬰幼兒中發(fā)病率和死亡率較高。然而RSV也可感染神經(jīng)系統(tǒng),引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,如嗜睡、抽搐、驚厥、癲癇等,目前已有多項(xiàng)關(guān)于RSV誘發(fā)腦病的臨床病例報(bào)道,但RSV感染神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制目前尚不明確,有待進(jìn)一步研究。中樞神經(jīng)元細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的功能細(xì)胞,它的異�？赡苤苯訉�(dǎo)致腦病癥狀的發(fā)生。已有文獻(xiàn)表明神經(jīng)元細(xì)胞上同時(shí)表達(dá)TLR4,目前已知小鼠神經(jīng)元細(xì)胞膜上表達(dá)TLR4受體,小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá)核仁素,而小鼠神經(jīng)元上是否表達(dá)核仁素受體目前尚未見(jiàn)報(bào)道,有待確認(rèn),并且這兩種受體可以同時(shí)識(shí)別RSV F蛋白,因此我們?cè)O(shè)想RSV可能通過(guò)這兩種受體的介導(dǎo)作用而直接感染神經(jīng)元,引起神經(jīng)元損傷病變。TLR3和TLR7是與RSV感染密切相關(guān)的受體,其中TLR7可以識(shí)別RSV的單鏈RNA, TLR3可識(shí)別RSV復(fù)制過(guò)程中所產(chǎn)生的雙鏈RNA,有文獻(xiàn)報(bào)道稱TLR3的激活可對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)證明,在RSV體外感染A549細(xì)胞及體內(nèi)感染BALB/c小鼠后,TLR3/TLR7表達(dá)量都呈上升趨勢(shì),本文通過(guò)檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞TLR3/TLR7表達(dá)量的變化以揭示病毒感染神經(jīng)元后細(xì)胞活化情況。本課題擬用RSV體外直接接種中樞神經(jīng)元,激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)病毒與受體結(jié)合情況,western blot技術(shù)檢測(cè)TLR4、核仁素表達(dá)情況,并檢測(cè)病毒感染后TLR3、TLR7活化及細(xì)胞損傷情況等,初步探討TLR4與C23介導(dǎo)RSV感染神經(jīng)元及損傷的相關(guān)機(jī)制。 目的：通過(guò)RSV接種中樞神經(jīng)元,觀察細(xì)胞內(nèi)病毒所在位置及神經(jīng)元病變損傷,探討RSV能否感染神經(jīng)元；通過(guò)檢測(cè)RSV感染神經(jīng)元后RSVF蛋白與受體TLR4、C23結(jié)合情況及細(xì)胞膜上TLR4和C23受體蛋白表達(dá)量變化,以及細(xì)胞內(nèi)TLR3、TLR7受體蛋白的活化,細(xì)胞凋亡損傷情況等,初步研究TLR4和C23受體在RSV感染及損傷神經(jīng)元過(guò)程中所起的作用,為臨床嬰幼兒RSV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的機(jī)理研究、治療和預(yù)防等提供新的思路。 方法：(1)用RSV直接接種體外培養(yǎng)的中樞神經(jīng)元N2a細(xì)胞,在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況,并用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化,然后用透射電鏡分別在不同的時(shí)間點(diǎn)觀察RSV感染能否進(jìn)入N2a細(xì)胞,病毒在細(xì)胞的位置。(2)激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察RSV感染N2a細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)變化,病毒F蛋白與TLR4和核仁素受體結(jié)合情況。(3)免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)RSV感染N2a細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞膜受體TLR4、C23及細(xì)胞內(nèi)受體TLR3、TLR7蛋白水平的變化,以未感染的細(xì)胞作為對(duì)照組。(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RSV感染N2a細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的凋亡病變情況。 結(jié)果：(1)透射電鏡結(jié)果顯示,RSV感染N2a1h, N2a細(xì)胞膜邊緣可見(jiàn)RSV病毒顆粒；RSV感染N2a2h和4h胞內(nèi)可見(jiàn)RSV病毒顆粒；感染12h和24h細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒增加；感染2d在細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)病毒包涵體；感染4d病毒量進(jìn)一步增加,并且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。 (2)激光共聚焦顯微鏡技術(shù)結(jié)果顯示,RSV感染N2a細(xì)胞1h,F蛋白與TLR4及核仁素受體都有結(jié)合,但與TLR4結(jié)合更多。RSV感染N2a細(xì)胞4d,可見(jiàn)細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生變化。 (3) western blot測(cè)定結(jié)果顯示,正常組中TLR4/C23、TLR3/TLR7蛋白水平表達(dá)量較低,而在RSV感染組,隨著感染時(shí)間增加,TLR3/TLR7表達(dá)不斷上調(diào)。TLR4/C23在RSV感染1h、2h和4h表達(dá)量逐漸增高,4h后表達(dá)量降低,到感染第4天,下降到與正常水平相接近。 (4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,RSV感染N2a細(xì)胞0h、1h、2h、4h、12h和24h,細(xì)胞均無(wú)早期凋亡及晚期凋亡變化,感染2d后可見(jiàn)細(xì)胞早期凋亡比例超過(guò)30%,感染3d和4d,早期凋亡比例和晚期凋亡比例均超過(guò)30%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且在感染的第2d-4d,隨著感染時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng),早期凋亡比例呈降低趨勢(shì),晚期凋亡比例呈上升趨勢(shì)。 結(jié)論：RSV可直接感染中樞神經(jīng)元N2a細(xì)胞,引起病變,同時(shí)可引起細(xì)胞膜受體TLR4和C23及細(xì)胞內(nèi)受體TLR3和TLR7蛋白表達(dá)量的變化,并且認(rèn)為RSV可通過(guò)與N2a細(xì)胞膜上的TLR4和C23受體結(jié)合從而進(jìn)入并感染N2a細(xì)胞,其中以TLR4的結(jié)合為主。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡旭;嬰幼兒重癥肺炎合并中毒性腦病的治療分析[J];安徽衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào);2005年03期

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本文編號(hào)：1336652