本文關鍵詞：出血性大腸桿菌（EHEC）O157:H7效應蛋白NleL和宿主蛋白ZBED1相互作用的發(fā)現(xiàn)與驗證　出處：《安徽師范大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：出血性大腸桿菌（EHEC）O157：H7是一種食源性和水源性的病原菌，該菌通過III型分泌系統(tǒng)將效應蛋白注入至宿主細胞中產(chǎn)生粘附與脫落（A/E）損傷而致病，它的感染會導致出血性腸炎并極有可能出現(xiàn)致命的出血性尿毒綜合癥，是一種全球范圍內(nèi)高度關注的病原菌。NleL(non-lee-encoded-effector-Ligase)是由Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的一種具有真核細胞泛素化E3連接酶活性的效應蛋白，然而它在宿主細胞內(nèi)的底物和作用機制尚不清楚。 本文通過蛋白質(zhì)表達重組子的構建、蛋白質(zhì)的誘導表達與純化、蛋白質(zhì)細胞內(nèi)定位、酵母雙雜交、GST pull-down和體外泛素化等實驗方法來篩選和驗證效應蛋白NleL在真核細胞內(nèi)的相互作用蛋白，取得了以下結果： 1.酵母雙雜交實驗篩選NleL可能作用于宿主的底物蛋白ZBED1 酵母雙雜交實驗初次篩選出可能與效應蛋白NleL相互作用的真核宿主細胞蛋白ZBED1，在SD-2和SD-4板均能生長的陽性克隆，經(jīng)擴增、雙酶切、測序分析比對后，發(fā)現(xiàn)的確是ZBED1序列，可初步推斷宿主蛋白ZBED1與效應蛋白NleL之間有可能存在相互作用。 2. NleL(GST-NleL)蛋白的誘導表達與純化 本研究成功純化了帶有GST和His雙標簽的NleL的全長蛋白GST-NleL-His和其帶單標簽的片段GST-NleL170-782-WT蛋白。結果表明，在純化方法上用GST-beads純化方法優(yōu)于用Ni-NTA方法；純化獲得的NleL融合蛋白的純度和質(zhì)量也滿足進一步實驗的要求，融合蛋白可以冷凍儲存為后續(xù)體外實驗備用。 3.效應蛋白NleL與宿主蛋白ZBED1結合試驗 用GST pulldown試驗驗證了宿主蛋白ZBED1與效應蛋白NleL的相互結合， western blot檢測顯示蛋白GST-NleL-His與NleL蛋白的片段GST-NleL170-782WT都與宿主蛋白ZBED1在體外產(chǎn)生較強的相互結合，由ZBED1與GST-NleL170-782WT的相互結合可以推測：效應蛋白NleL與宿主蛋白ZBED1相互結合的位點有可能位于第170-782氨基殘基之間。 4.效應蛋白NleL與宿主蛋白ZBED1的體外泛素化試驗 已有研究顯示NleL具E3連接酶活性，，且其泛素化的活性與第753位的半胱氨酸殘基有關，本研究通過NleL與ZBED1體外泛素化實驗探究了NleL是否通過該活性作用于底物ZBED1。結果表明，宿主蛋白ZBED1存在自泛素化現(xiàn)象，NleL全長蛋白融合蛋白GST-NleL-His、NleL的第753位點突變片段融合蛋白GST-NleL170-782C753A與底物ZBED1蛋白相互作用后，ZBED1的自泛素化作用明顯減弱，效應蛋白NleL可能是通過影響宿主蛋白ZBED1的自泛素化作用而影響宿主細胞的生理活動；NleL的第753位點突變片段融合蛋白GST-NleL170-782C753A與未突變的全長蛋白作用效果相同，表明NleL蛋白不是通過E3連接酶的活性來影響ZBED1的生理作用的。 5.效應蛋白NleL在真核細胞內(nèi)的表達與定位 明確效應蛋白NleL在細胞內(nèi)的定位對于探究其在真核細胞中的作用機制是十分必要的。本研究成功構建出能夠在真核細胞中表達帶EGFP的NleL融合蛋白重組質(zhì)粒pCDNA3.0-UTR-EGFP-NleL-HA，將該質(zhì)粒和對照質(zhì)粒pCDNA3.0-UTR-EGFP-HA轉(zhuǎn)染293T和Hela細胞后，觀察顯示NleL蛋白絕大多數(shù)定位在細胞質(zhì)內(nèi)，亦有少量進入到細胞核中；對照組EGFP熒光蛋白在整個細胞中均有分布，沒有明顯的細胞定位特異性。由此可推測，NleL效應蛋白進入真核細胞后，可能在細胞質(zhì)中和細胞核中與不同的底物蛋白發(fā)揮不同的作用。 總之，本研究通過酵母雙雜交系統(tǒng)首次成功篩選到效應蛋白NleL在宿主細胞中的潛在底物ZBED1，并且通過GST pull-down試驗和與體外泛素化試驗初步探討了NleL蛋白的相互作用，并明確了NleL蛋白在真核細胞內(nèi)的定位，為今后進一步探究該蛋白在真核細胞內(nèi)的作用機理提供了線索。
【學位授予單位】：安徽師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378.21

【共引文獻】

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本文編號：1329145