本文關(guān)鍵詞：HCMV基因在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及病毒感染對(duì)細(xì)胞自噬的影響

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【摘要】：目的： 1.檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalo virus, HCMV)基因在人胚胎成纖維細(xì)胞(Human embryo fibroblast, HEF)和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryo fibroblast,MEF)中的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究HCMV種屬特異性的機(jī)制奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。 2.觀察HCMV感染對(duì)HEF和MEF細(xì)胞自噬的影響,為HCMV種屬特異性的研究尋找新的方向和證據(jù)。 方法： 1.組織塊分離培養(yǎng)法結(jié)合膠原酶消化法分離原代HEF和MEF細(xì)胞。 2.在HEF細(xì)胞中擴(kuò)增HCMV AD169毒株,空斑定量法測(cè)定病毒滴度。 3.相差顯微鏡下觀察病毒感染(M0I=5)后HEF和MEF細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。 4. RT-PCR、Western-blot、免疫熒光法檢測(cè)HCMV-IE、UL84、UL83的表達(dá)。 5.MTT比色法檢測(cè)HEF和MEF細(xì)胞的增殖活性。 6.單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)染色法和透射電鏡檢測(cè)胞內(nèi)自噬體。 7. Western-blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclinl和LC3的表達(dá)：免疫熒光法檢測(cè)LC3的表 達(dá)。 結(jié)果： 1.成功分離培養(yǎng)并純化原代HEF和MEF細(xì)胞,傳代后細(xì)胞狀態(tài)良好。 2.用HCMV分別感染HEF和MEF細(xì)胞后,HEF細(xì)胞第2d逐漸變大變圓并相互融合,第4d超過(guò)80%細(xì)胞可見(jiàn)典型的HCMV特征性病變效應(yīng)(CPE),而MEF細(xì)胞在相應(yīng)時(shí)間未出現(xiàn)上述的變化。 3. RT-PCR和Western-blot表明HEF細(xì)胞表達(dá)HCMV-IE1、IE2、UL84和UL83mRNA以及其編碼的蛋白,相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組(P0.01)；而MEF細(xì)胞僅表達(dá)IE1和IE2mRNA和蛋白,且相對(duì)表達(dá)量顯著低于HEF細(xì)胞(P0.05)。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCMV感染HEF細(xì)胞72h表達(dá)IE和UL83蛋白,而MEF細(xì)胞則無(wú)明顯表達(dá)。 4.MTT檢測(cè)顯示HCMV感染HEF細(xì)胞24h內(nèi),細(xì)胞增殖活性升高,24h后隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,而HCMV感染MEF細(xì)胞后,96h內(nèi)細(xì)胞增殖活性持續(xù)升高(P0.05)。 5.MDC染色后觀察顯示HEF和MEF細(xì)胞感染后24h,多數(shù)核周出現(xiàn)的大量藍(lán)綠色的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu),24h后HEF細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸減少,細(xì)胞內(nèi)藍(lán)綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)密度減弱,而MEF細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞內(nèi)藍(lán)綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)密度仍然逐漸增強(qiáng),明顯高于HEF感染組。 6.透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)HCMV惑染后HEF和MEF細(xì)胞漿內(nèi)均出現(xiàn)大量囊泡狀結(jié)構(gòu),高倍鏡下可見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu),其中包含未完全降解或者已降解的細(xì)胞器等。 7. Western-blot吉果顯示,HCMV感染HEF和MEF細(xì)胞后Beclin1和LC3-II/LC3-I的相對(duì)表達(dá)量升高,顯著高于模擬感染組(P0.01)：而HEF細(xì)胞在感染24h后逐漸降低,但高于正常對(duì)照組(P0.01)；而MEF細(xì)胞24hBeclin1和LC3-II/LC3-I的相對(duì)表達(dá)量逐漸升高,顯著高于HEF組(P0.05)。免疫熒光檢測(cè)LC3蛋白結(jié)果與Western-blot結(jié)果一致。 結(jié)論： 1. HCMV在MEF細(xì)胞中的復(fù)制停滯在IE2基因表達(dá)之后和UL84基因表達(dá)之前的時(shí)相,不能產(chǎn)生完整的子代病毒顆粒。推斷即刻早期蛋白在MEF細(xì)胞內(nèi)的低水平表達(dá)可能與HCMV的種屬特異性相關(guān)。 2. HCMV感染早期誘導(dǎo)HEF和MEF細(xì)胞發(fā)生自噬,但感染后期HEF細(xì)胞的自噬效應(yīng)被抑制,而MEF細(xì)胞的自噬并不被明顯抑制。 3. HCMV感染導(dǎo)致HEF和MEF細(xì)胞的不同自噬效應(yīng)可能與病毒編碼蛋白IE之后的蛋白表達(dá)相關(guān)
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 趙楊,陳敦金,聞良珍;人巨細(xì)胞病毒基因時(shí)序表達(dá)對(duì)感染結(jié)局的影響[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2004年10期

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本文編號(hào)：1297516