本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌噬菌體LSB-1裂解酶基因gp17的表達、抗菌效應(yīng)分析及優(yōu)化設(shè)計預(yù)測

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【摘要】：自噬菌體被發(fā)現(xiàn)以來便廣發(fā)被用于抗菌相關(guān)研究。但是自弗萊明于1928年意外發(fā)現(xiàn)青霉素作為抗菌藥物以后，由于抗生素治療效果顯著，且噬菌體研究不夠成熟，利用噬菌體進行抗菌一直處于擱置狀態(tài)。2001年Nelson等通過重組表達獲得了純化的噬菌體裂解酶并將其作為抗菌物質(zhì)進行研究。近年來，，隨著耐藥菌的廣泛產(chǎn)生以及環(huán)境保護面臨嚴峻壓力，以及抗生素的研發(fā)周期遠長于細菌對該物質(zhì)產(chǎn)生耐藥的周期，對噬菌體抗菌功能的探索及應(yīng)用產(chǎn)品的開發(fā)逐漸成為醫(yī)學(xué)研究熱點之一。噬菌體的天然抗菌效應(yīng)和通過分子生物學(xué)技術(shù)人工修飾的改良產(chǎn)物表現(xiàn)特色給環(huán)境凈化、水體凈化、食物安全及臨床抗菌應(yīng)用開辟了新的發(fā)展方向。2013年歐洲還成立了PhagoBurn項目專門用于研究噬菌體治療燒傷后大腸桿菌和綠膿桿菌感染問題。 噬菌體作為細菌病毒，能夠特異性識別和裂解細菌，其滅菌效應(yīng)被越來越多的研究者關(guān)注。噬菌體裂解酶作為噬菌體在進入細菌之前溶解細胞壁以及在宿主體內(nèi)繁殖之后裂解細菌、釋放子代噬菌體的關(guān)鍵酶，現(xiàn)正受到越來越多的研究者的重視并對其進行進一步研究。 本教研室在醫(yī)院的污水池中分離到一株大腸桿菌噬菌體并將其命名為LSB-1，初步研究發(fā)現(xiàn)了該噬菌體裂解細菌的相關(guān)酶基因gp17，并對其進行測序后提交至GenBank（GenBank序列號: KC425724.1）。本研究通過原核表達技術(shù)將唾液酸酶基因克隆到質(zhì)粒pET300構(gòu)建重組質(zhì)粒pET300-gp17，然后再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)進行誘導(dǎo)表達，并對表達的蛋白進行純化，最終獲得了gp17基因表達的純化蛋白。采用KB紙片法對純化重組蛋白的有效菌譜進行測定，并將測定結(jié)果與通過噬菌體展示技術(shù)將gp17基因重組到T7噬菌體得到的T7-LSB-gp17重組噬菌體的有效菌譜進行比較，并對其結(jié)果進行分析。為了進一步提高酶活性，擬對gp17唾液酸酶的關(guān)鍵氨基酸進行突變以增強其活性，并用AutoDock分子對接軟件對替換后的蛋白和唾液酸進行對接以查看替換后蛋白和唾液酸的結(jié)合效果。研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1．唾液酸酶基因的克隆、表達和純化：利用基因重組技術(shù)將EIEC8401噬菌體LSB-1裂解酶基因gp17構(gòu)建到表達載體質(zhì)粒pET300中,并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達及純化，最終獲得了gp17基因通過重組成功表達出分子量為78kDa的溶解蛋白；利用BCA法測定純化重組蛋白的含量，純化后濃度為2.38mg/ml。 2．利用抑菌實驗檢測重組蛋白的抑菌活性：以大腸桿菌、葡萄球菌等多種細菌等為試驗菌采用Kirby-Bauer紙片法對重組噬菌體唾液酸酶的有效作用菌譜進行測定，發(fā)現(xiàn)重組噬菌體酶對噬菌體宿主菌EIEC8401有良好的抑菌作用，經(jīng)過5小時的培養(yǎng)能夠見到直徑約為2cm、明顯的抑菌圈，對其他種類的細菌無明顯抑菌作用，顯示該噬菌體酶具有高度特異性，這種特異性與T7噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)物（重組噬菌體T7-LSB-gp17較寬的宿主譜）不同。 3．采用結(jié)構(gòu)域單獨表達法與非保守位點突變法為理論依據(jù)設(shè)計突變體，通過AutoDock軟件分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將結(jié)構(gòu)域直接進行表達(突變體2)以及非保守位點124位(突變體6)和167位(突變體7)的天冬酰胺改變?yōu)榻z氨酸獲得的突變體進行表達獲得突變體具有結(jié)合能更低、與底物結(jié)合能力更強。用信息技術(shù)對突變體進行顯示了生物信息學(xué)差異。 綜上所述，本研究將噬菌體裂解細菌的唾液酸酶進行克隆、表達和純化獲得目的蛋白，進行體外活性檢測發(fā)現(xiàn)其對EIEC8401有較好的特異性，其結(jié)果與通過噬菌體展示技術(shù)獲得的重組噬菌體T7-LSB-gp17有較大的差異；通過對酶的相關(guān)位點進行突變，獲得了一系列突變株，采用AutoDock進行對接，預(yù)測顯示將結(jié)構(gòu)域直接進行表達(突變體2)以及非保守位點124位(突變體6)和167位(突變體7)的天冬酰胺改變?yōu)榻z氨酸獲得的突變體具有較原蛋白更好的結(jié)合能力，通過分析認為其活性增加是由于其結(jié)構(gòu)改變引起的，可以進行下一步實驗進行驗證。本研究的結(jié)果為進一步研究該唾液酸酶的功能、機制等方面奠定了一定的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378.21

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 朱曉艷;胡福泉;譚銀玲;;摩氏摩根菌噬菌體MmP1內(nèi)溶素重組蛋白活性的初步鑒定[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2011年23期

2 賈鳴;胡曉梅;孫衛(wèi)忠;饒賢才;叢延廣;胡福泉;;銅綠假單胞菌噬菌體PaP3多糖解聚酶基因的克隆表達及生物學(xué)活性[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2008年02期

3 黃虎翔;張萬明;;解淀粉芽孢桿菌的流行狀況及毒素作用[J];國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2010年03期

4 常珊;孔韌;李春華;陳慰祖;王存新;;基于MPI的分子對接并行算法[J];計算物理;2008年02期

5 宋彬;熊鴻燕;徐焰;馬翔宇;張路;;Isolation of a novel polyvalent virulent bacteriophage of E.coli[J];Journal of Medical Colleges of PLA;2007年05期

6 黃虎翔;王輝;張萬明;;解淀粉芽孢桿菌對嬰幼兒潛在致病性的研究[J];臨床兒科雜志;2010年02期

7 朱才眾;熊鴻燕;崔步云;任謙;樸東日;馬翔宇;;裂解型布魯氏菌噬菌體的分子特征研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2009年09期

8 鄺愛麗;陳圓圓;彭志峰;鄭鹿平;付仁一;徐雪;郭倫濤;王川慶;;包涵體的形成原因及其處理方法[J];上海畜牧獸醫(yī)通訊;2009年01期

9 劉倩;趙玉軍;;噬菌體展示技術(shù)研究進展[J];微生物學(xué)雜志;2007年06期

10 張晨飛;秦愛建;鄧緒方;蘇鈺文;薛敏;尹天燕;王平平;;馬立克氏病病毒Ⅰ型CVI988/Rispens疫苗株UL13激酶結(jié)構(gòu)域分析及其偏嗜密碼子片段在大腸桿菌中的表達[J];微生物學(xué)報;2009年02期

本文編號：1295846