本文關鍵詞：靶向LOX-1基因RNAi慢病毒載體的構建及其對內皮細胞凋亡的影響

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【摘要】：目的 1、構建靶向凝集素樣氧化性低密度脂蛋白受體(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1, LOX-1)基因的RNA干擾(RNA interference, RNAi)慢病毒載體,包裝病毒篩選最佳沉默靶點。 2、研究沉默LOX-1表達后對氧化性低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)誘導的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)凋亡的影響。 方法 1、針對LOX-1基因(OLR1)設計并合成3條siRNA干擾靶序列,與雙酶切的線性U6-vshRNA-CMV-GFP慢病毒載體連接得到重組載體,并與包裝輔助質粒共轉染293T細胞獲得慢病毒顆粒,逐步稀釋法測定病毒滴度。 2、通過實驗測得最佳感染指數(multiplicity of infection, MOI)及轉染條件,按照分組：未轉染病毒組(CON組),病毒陰性對照轉染組(LV-NC組),病毒陽性轉染組(LV-OLR1-RNAi-1組,LV-OLR1-RNAi-2組,LV-OLR1-RNAi-3組)轉染HUVECs,轉染96h后通過RT-PCR和Western Blotting分別檢測LOX-1mRNA及蛋白的表達情況,篩選最佳干擾靶序列。 3、采用方法2中篩選的最佳干擾靶序列,按照分組：正常對照組,ox-LDL處理組,ox-LDL+LV-NC慢病毒轉染組,ox-LDL+LV-OLR1-最佳干擾序列慢病毒轉染組,轉染72h后,除外正常對照組(只加無血清培養(yǎng)基)加入含有ox-LDL(終濃度為150μg/ml)的無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后,采用MTT比色法檢測細胞存活率及增殖情況,流式細胞儀檢測細胞凋亡,Western Blotting檢測各組細胞凋亡基因Bcl-2/Bax的表達情況。 結果 1、測序證實,靶向LOX-1RNAi慢病毒載體構建成功,測定病毒滴度為(4-6)×108TU/ml。 2、轉染預實驗通過觀察綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)表達及細胞生長狀態(tài)得出：MOI=20且在終濃度為5μg/mlPolybrene的條件下細胞轉染96h轉染效率達到90%以上且細胞生長狀態(tài)佳,并且GFP持續(xù)穩(wěn)定表達。 3. RT-PCR和Western Blotting結果分別從mRNA和蛋白水平顯示LOX-1的表達在CON組與LV-NC組之間不具有統計學差異,病毒陽性轉染組與CON組和LV-NC組之間具有統計學差異(P0.05),其表達皆有不同程度的抑制,其中以I_V-OLR1-RNAi-3組的抑制率最高。 4、MTT檢測結果顯示給予ox-LDL處理后,未干預LOX-1表達組的細胞存活率較正常對照組明顯降低,細胞增殖減少,差異有統計學意義(P0.05)；而給予LV-OLR1-RNAi轉染預處理的細胞再進行ox-LDL處理后,細胞存活率較未干預LOX-1表達組明顯升高,細胞增殖增加,差異有統計學意義(P0.05)；流式細胞儀檢測結果亦顯示給予LV-OLR1-RNAi轉染預處理的細胞ox-LDL誘導的細胞凋亡率明顯小于未干預LOX-1表達組(P0.05)。 5、Western Blotting測定凋亡蛋白結果顯示單純給予ox-LDL處理后Bcl-2表達降低,Bax表達升高,Bcl-2/Bax比例減小,差異有統計學意義(P0.05)；而抑制LOX-1表達后再給予ox-LDL處理,則Bcl-2表達升高,Bax表達降低,Bcl-2/Bax比例增加,差異有統計學意義(P0.05)。 結論 1、本研究運用RNAi技術成功構建靶向LOX-1RNAi慢病毒載體,并有效抑制LOX-1表達。 2、干擾LOX-1表達后,可減少ox-LDL誘導HUVECs的凋亡率,增加其存活率,并通過增加Bcl-2表達,抑制Bax表達,提高Bcl-2/Bax比例來抑制。x-LDL誘導的內皮細胞凋亡,起到抗動脈粥樣硬化的作用。
【學位授予單位】：遼寧醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R373

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 王春霞;;RNA干擾技術在臨床中的應用[J];臨床醫(yī)學;2009年09期

2 萬春鵬;周壽然;左愛仁;;RNA干擾機制及其應用研究進展[J];現代生物醫(yī)學進展;2008年02期

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本文編號：1288982