本文關鍵詞：機械拉伸對成骨細胞基因表達及可變剪接的研究

  更多相關文章： 應力 成骨細胞 可變剪接 剪接因子

【摘要】：人體內許多組織和器官都受到來自生理環(huán)境的不同類型和大小的應力作用，骨是人體內重要的結構和功能組織，研究應力作用對骨組織生長發(fā)育的影響有助于骨組織修復工程的發(fā)展。應力刺激可以改變細胞內基因的表達和可變剪接過程，本文利用生物力學、分子生物學等手段研究拉伸刺激對成骨細胞內力響應基因的表達和可變剪接的影響，以及可能的可變剪接調控機制。 主要研究內容和結果如下： 培養(yǎng)小鼠成骨細胞株MC3T3-E1和人永生化表皮細胞株HaCaT，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)良好，MC3T3-E1細胞呈纖維樣細胞型，HaCaT細胞呈上皮樣細胞型。 將成骨細胞MC3T3-E1接種到硅橡膠膜上，應用自主設計制作的應力拉伸裝置對MC3T3-E1細胞施加拉伸刺激，加載參數(shù)為：應變量15%、頻率30次/min、加載時間分別為3h和6h，收集細胞提取總mRNA和蛋白，研究拉伸刺激對VEGF、CD44和cyclinD1基因表達的影響。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)拉伸前后VEGF基因主要表達剪接變異體VEGF188、VEGF164和VEGF120，CD44基因主要表達剪接變異體CD44S和CD44E，cyclinD1基因主要表達剪接變異體cyclinD1a。利用q-PCR和western blot檢測表達量變化發(fā)現(xiàn)拉伸刺激后VEGF及其剪接變異體VEGF164和VEGF120表達量明顯上調，cyclinD1及其剪接變異體cyclinD1a表達量明顯下調，，而CD44及其剪接變異體CD44S和CD44E表達量改變不明顯。 構建剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1的真核表達質粒pcDNA3.1(+)-EGFP-ASF/SF2、pcDNA3.1(+)-EGFP-SC35和pcDNA3.1(+)-EGFP-hnRNPA1，轉染HaCaT細胞以模擬拉伸刺激后細胞內剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1表達上調的狀態(tài)，研究應力拉伸環(huán)境下剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1對VEGF基因可變剪接的影響。熒光顯微鏡下觀察到表達質粒轉染效率約70%，western blot檢測ASF/SF2、SC35和hnRNPA1蛋白的表達，檢測結果證明其表達量明顯增加。且過表達ASF/SF2和SC35后VEGF剪接變異體VEGF188、VEGF164和VEGF120蛋白表達量顯著下調，而過表達hnRNPA1對VEGF剪接變異體的表達改變不明顯。說明ASF/SF2和SC35參與應力拉伸環(huán)境下對VEGF基因可變剪接的調控過程，而hnRNPA1不參與該過程。
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 萬敬員,張力,葉篤筠;選擇性剪接調控機制的研究進展[J];國外醫(yī)學(分子生物學分冊);2003年06期

2 邢東明,張平,王琦,韓鳳岳,羅致誠;壓應力對體外培養(yǎng)的軟骨細胞產生細胞因子的影響[J];解剖學報;2001年04期

3 謝慶軍;范凌云;李季風;胡曉燕;;Kozak序列引導的人p53基因重組智能腺病毒載體的構建與表達[J];中國生物制品學雜志;2008年02期

4 馬艷嬌;李鵬;周海峰;阮楠;宮鵬濤;李建華;歐陽紅生;張西臣;;Kozak序列對TIMP1基因在人乳腺癌細胞MCF-7中表達的影響[J];中國生物制品學雜志;2010年07期

5 王衛(wèi)國,婁思權,鄭多,夏家輝;轉化生長因子β2真核表達載體pcDNA3.1(+)/TGF-β2的構建及其在骨髓基質細胞的表達[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2003年07期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉歡;應力環(huán)境下成骨細胞差異基因表達及選擇性剪接調控研究[D];重慶大學;2012年

本文編號：1287320