發(fā)布時間：2017-12-11 12:33

  本文關(guān)鍵詞：Kindlin-2與Prdx4之間的相互作用研究

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【摘要】：Kindlin是上世紀(jì)50年代新發(fā)現(xiàn)的黏著斑蛋白家族,到目前為止,已確定該家族含有3個成員(Kindlin-1, Kindlin-2, Kindlin-3)。越來越多的證據(jù)表明Kindlins通過整合素在細(xì)胞黏附中起到重要作用,已有研究證實它們與皮膚疾病發(fā)生、心血管生成、免疫系統(tǒng)功能、腫瘤的侵襲、腫瘤耐藥等有密切關(guān)系,它們作為信號分子參與了細(xì)胞黏附、遷移、增殖和分化的調(diào)控。 Kindlin家族不僅具有高度的同源性,還具有高度的保守性。Kindlin-2與Kindlin-1蛋白有62%的氨基酸相同,Kindlin-3與Kindlin-1有49%的氨基酸相同,Kindlin-2與Kindlin-3有53%的氨基酸相同。Kindlin含有一個典型的FERM結(jié)構(gòu)域,這種結(jié)構(gòu)多見于細(xì)胞骨架蛋白。它由3個亞結(jié)構(gòu)域組成,分別為F1、F2、F3,在核心序列前往往有F0亞結(jié)構(gòu)域。Kindlins中的F3與踝蛋白(talin) FERM中的F3高度相似,同樣含有磷酸酪氨酸結(jié)合區(qū)(phosphotyrosine-binding domain, PTB),這種結(jié)構(gòu)域可結(jié)合整合素β3亞基胞質(zhì)尾區(qū)。 Kindlin-2定位于細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)黏著點,直接與整合素連接激酶(integrin-linked kinase, ILK)和黏附結(jié)構(gòu)蛋白相互作用,并且Kindlin-2或黏附結(jié)構(gòu)蛋白的下調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞延展受損。Kindlin-1和Kindlin-2都可以通過結(jié)合整合素胞質(zhì)尾段定位于黏著斑。Kindlin-2連接黏附結(jié)構(gòu)蛋白,黏附結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合血管擴(kuò)張激活的磷酸蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein, VASP)和細(xì)絲蛋白(filamin),成為細(xì)胞-基質(zhì)黏附復(fù)合體與肌動蛋白細(xì)胞骨架之間的重要連接。Kindlin-2對整合素的激活起著至關(guān)重要的作用。Kindlin-2的信號傳導(dǎo)分為兩部分,即信號由內(nèi)到外傳導(dǎo)和由外到內(nèi)的傳導(dǎo)過程。盡管多種蛋白質(zhì)都能與β整合素胞內(nèi)段相互作用,但在Kindlin的功能得到闡明之前,只有踝蛋白被確切證實能夠觸發(fā)整合素活化。然而事實上,在小鼠基因敲除的研究中,證實了Kindlin才是整合素活化所必需的。 Kindlin-2有可能在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中也扮演著重要角色。許多研究都表明,Kindlin-2的表達(dá)水平改變與某些腫瘤密切相關(guān)。我們的前期研究也證實,Kindlin-2的表達(dá)水平不但與前列腺癌的惡性程度密切相關(guān),而且調(diào)控著前列腺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。另外,Kindlin-2在不同肺癌細(xì)胞系中表達(dá)不同,且其過表達(dá)可顯著促進(jìn)U-1752細(xì)胞的遷移。Kindlin家族成員可能通過與整合素的作用來參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程的調(diào)節(jié),但其機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。 鑒于Kindlin-2在整合素活化中的關(guān)鍵性作用以及與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展的密切相關(guān)性,我們開展了尋找新的Kindlin-2相互作用蛋白的工作。在前期研究中,我們利用特異性抗Kindlin-2抗體對前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞裂解物進(jìn)行pulldown,樣品利用2-D熒光差異蛋白表達(dá)分析系統(tǒng)(2-DDIGE)進(jìn)行分析。2-DDIGE系統(tǒng)是在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上,結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒?在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標(biāo)記的樣品,獲得差異點后,我們利用全自動凝膠取點、酶解、點樣工作站對差異點進(jìn)行處理,隨后用4800型MALDI-TOF/TOF分析儀對差異點進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。在得出的差異點中,其中一個令人感興趣的蛋白是過氧化物酶蛋白(peroxiredoxin, Prdx)家族的一個成員Prdx4。 過氧化物酶蛋白是一個多功能蛋白家族,它有清除生物體內(nèi)氧自由基的作用,研究表明長期的體能鍛煉能上調(diào)過氧化物酶蛋白的表達(dá),以及結(jié)合許多慢性疾病過程中所產(chǎn)生的氧自由基,同樣在免疫應(yīng)激條件下,過氧化物酶蛋白呈過氧化狀態(tài)以此保護(hù)機(jī)體免受損傷。過氧化物酶蛋白家族成員分子量大小在20～30kDa范圍內(nèi),且廣泛分布在生物體內(nèi)。在大多數(shù)人類細(xì)胞中,它占到可溶性蛋白的0.1-1%,并且是紅細(xì)胞胞質(zhì)的第三大蛋白。過氧化物酶蛋白家族的六個亞型在人體的定位有顯著的區(qū)別,根據(jù)該家族蛋白參與氧化還原反應(yīng)的半胱氨酸殘基數(shù)目,將其家族分為三類：即典型的2-Cys-Prdx (Prdx1～4),非典型的2-Cys-Prdx (Prdx5),以及1-Cys-Prdx (Prdx6)。 越來越多的證據(jù)提示Prdx的表達(dá)水平與腫瘤密切相關(guān),甚至有人提出Prdx可作為腫瘤標(biāo)志物。例如,Prdx3和Prdx4在前列腺癌中的表達(dá)都明顯增加,且Prdx4被提出可作為前列腺癌活檢的生物標(biāo)志物。另外,在肺癌中也發(fā)現(xiàn)Prdx4的表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞過表達(dá)Prdx2時對順鉑的耐受性增加,而下調(diào)其表達(dá)則促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。鑒于Prdx4參與氧化應(yīng)激且與腫瘤之間的密切關(guān)系,且我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Kindlin-2也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有高度相關(guān)性,因而我們推測Prdx4與Kindlin-2的相互作用可能參與了炎癥導(dǎo)致的腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。 基于以上認(rèn)識,我們在本課題研究中,開展了以下工作： 第一部分：pmcherry-Nl-Prdx4和pEGFP-C3-Kindlin-2載體的構(gòu)建及鑒定 將帶有紅色熒光蛋白pmcherry和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的融合蛋白表達(dá)載體中分別引入人Prdx4和Kindlin-2全長序列,完成了融合蛋白表達(dá)載體pmcherry-N1-Prdx4和pEGFP-C3-Kindlin-2的構(gòu)建。融合了EGFP的Kindlin-2和1ncherry的Prdx4在細(xì)胞內(nèi)具有高效的表達(dá)能力,且無細(xì)胞選擇性。構(gòu)建完成的pEGFP-C3-Kindlin-2和pmcherry-N1-Prdx4載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞后,不但有助于觀察其細(xì)胞內(nèi)定位情況,而且還可用于后續(xù)的功能實驗和實時動態(tài)實驗。 第二部分：Kindlin-2與Prdx4相互作用的驗證 1、外源性免疫共沉淀驗證Kindlin-2與Prdx4相互作用 為了明確Kindlin-2與Prdx4是否有相互作用,我們將HA標(biāo)記的Prdx4載體與FLAG標(biāo)記的Kindlin-2載體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后進(jìn)行免疫共沉淀,并設(shè)單轉(zhuǎn)染組作為對照,結(jié)果證實兩者具有相互作用。鑒于Prdx4是一種過氧化物酶,我們想進(jìn)一步了解氧化應(yīng)激對兩者的相互作用有何影響,選取90min作為刺激時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在受到H202刺激后,兩者的相互作用較刺激前顯著增加。 2、內(nèi)源性免疫共沉淀驗證Kindlin-2與Prdx4相互作用 我們首先分別用NaAsO2刺激PC-3細(xì)胞0min、5min、15min、30min、45min、60min、90min和120min, Western blot檢測了細(xì)胞內(nèi)Kindlin-2和Prdx4的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)量隨著時間的延長并未發(fā)生變化。接著收取PC-3細(xì)胞做內(nèi)源性的免疫共沉淀實驗,選擇NaAsO2刺激90min組,設(shè)不加刺激組和無關(guān)抗體組作為對照。結(jié)果證實兩者具有相互作用,且細(xì)胞在受到NaAsO2刺激后兩者的相互作用較刺激前顯著增加,與外源性免疫共沉淀實驗結(jié)果相一致。 第三部分：Kindlin-2和Prdx4在細(xì)胞內(nèi)的共定位 1、外源性Kindlin-2與Prdx4在細(xì)胞內(nèi)的共定位 我們將pEGFP-C3-Kindlin-2和pmcherry-N1-Prdx4共轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞,并檢測到在細(xì)胞內(nèi)皆有表達(dá),然后用共聚焦顯微鏡觀察二者在空間位置上有無共定位現(xiàn)象。同樣選擇NaAsO2刺激90min組,設(shè)不加刺激組和共轉(zhuǎn)EGFP空載體與pmcherry-N1-Prdx4組作為對照。結(jié)果提示：pEGFP-C3-Kindlin-2在胞漿與胞核中均有分布,而pmcherry-N1-Prdx4主要分布在胞質(zhì),在NaAsO2未刺激組中pEGFP-C3-Kindlin-2和pmcherry-N1-Prdx4有少量的共定位,細(xì)胞在受到NaAsO2刺激后兩者的共定位較刺激前顯著增加。 2、內(nèi)源性Kindlin-2與Prdx4在細(xì)胞內(nèi)的共定位 我們進(jìn)一步在PC-3細(xì)胞中做內(nèi)源性的免疫熒光實驗,分別用紅色熒光和綠色熒光標(biāo)記Prdx4和Kindlin-2,選擇NaAsO2刺激90min組,設(shè)不加刺激組和單轉(zhuǎn)EGFP空載體組作為對照。結(jié)果提示：在未受刺激時,Kindlin-2主要分布在胞漿和胞核中,而Prdx4只分布于胞漿中,Prdx4與Kindlin-2有少量共定位；NaAsO2刺激后兩者共定位顯著增強(qiáng),與外源性結(jié)果相一致。 通過以上研究,我們得出以下幾點結(jié)論： 1、完成pEGFP-C3-Kindlin-2和pmcherry-N1-Prdx4融合載體的構(gòu)建及鑒定,并在PC-3細(xì)胞內(nèi)有穩(wěn)定的表達(dá)。 2、外源性免疫共沉淀實驗初步證實H202刺激可明顯誘導(dǎo)Kindlin-2與Prdx4的相互作用。 3、內(nèi)源性免疫共沉淀實驗證實NaAsO2刺激可顯著增強(qiáng)Kindlin-2與Prdx4之間的相互作用。 4、熒光蛋白標(biāo)記的Kindlin-2與Prdx4在空間位置上具有共定位現(xiàn)象,且在NaAsO2刺激后共定位增強(qiáng)。 5、內(nèi)源性免疫熒光實驗證實Kindlin-2與Prdx4有共定位現(xiàn)象,且在NaAsO2刺激后共定位增強(qiáng)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1278503