本文關(guān)鍵詞：阪崎克羅諾桿菌間毒力比較與致病因子研究

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【摘要】：阪崎克羅諾桿菌是一種無芽孢的兼性厭氧革蘭氏陰性菌,它容易寄生于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)。現(xiàn)有研究已表明嬰幼兒配方奶粉是致嬰幼兒、早產(chǎn)兒敗血癥、腦膜炎以及壞死性結(jié)腸炎的主要感染來源渠道,可導(dǎo)致嬰幼兒高達(dá)40%～80%的死亡率。近年來阪崎克羅諾桿菌已被廣泛關(guān)注,針對(duì)其危害的研究也越來越深入。然而,對(duì)其致病機(jī)理的探討目前還非常薄弱。因此,針對(duì)阪崎克羅諾桿菌的致病機(jī)理的研究將是今后研究的熱點(diǎn),這對(duì)于預(yù)防和治療阪崎克羅諾桿菌的感染具有重要意義。 為了進(jìn)一步了解阪崎克羅諾桿菌的致病機(jī)理,本研究利用實(shí)驗(yàn)室已有43株菌株,通過對(duì)SD乳鼠進(jìn)行活菌灌胃后、統(tǒng)計(jì)血液、腦組織中活菌數(shù)、以及腸組織與剩余尸體比的數(shù)據(jù),來比較不同菌株的毒性大小。結(jié)果顯示,7、23、36、38、50、52號(hào)菌株毒性較高,17、18、22、24、26、27、28、31、32、47、48、49號(hào)菌株毒性較低。為了進(jìn)一步獲得毒性因子,本研究結(jié)合Box-PCR分型結(jié)果,挑選出親源關(guān)系關(guān)系較近的36號(hào)菌株(高毒菌株)和17號(hào)菌株(低毒菌株),通過二維電泳比較其差異蛋白,從中篩選獲得毒性相關(guān)因子。通過比較兩株菌的二維電泳圖譜,共發(fā)現(xiàn)108個(gè)差異蛋白點(diǎn)。通過質(zhì)譜鑒定,101個(gè)蛋白被成功鑒定。對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行相似的數(shù)據(jù)分析與資料查閱,共發(fā)現(xiàn)15個(gè)可能與毒力相關(guān)的蛋白,他們分別是(iroEL, HtpG, DegP,ClpB, OmpW, Flagellin, TerE, TerZ, TerD, TerX, TerA, VirB4, BipA,以及未知功能蛋白MLBr01669和yxxBOS。 在前期的研究工作基礎(chǔ)上,選擇了三種未知功能蛋白的基因,它們分別是生物膜.相關(guān)基因ESA02170、表面蛋白相關(guān)基因ESA02516、以及文獻(xiàn)報(bào)道的毒力相關(guān)基因ESA02736,通過基因敲除研究其毒力相關(guān)性。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出含有酶切位點(diǎn)的上下游片段及氯霉素抗性片段,并利用重組DNA技術(shù)將三部分連接至pMD18-T,成功構(gòu)建出高特異性的長片段敲除載體。其中,ESA_02170基因的上游片段為672bp、下游片段為615bp,敲除片段全長為2283bp；ESA_02516基因基因的上游片段為791bp、下游片段為632bp,敲除片段全長為3508bp；ESA-02736基因的上游片段為661bp、下游片段為652bp,敲除片段全長為2117bp。將含有重組酶基因的敲除載體pKD46電轉(zhuǎn)化至ATCC BAA-894號(hào)菌株中,制備了能夠表達(dá)重組酶的宿主菌株。將敲除片段轉(zhuǎn)入含有pKD46的宿主菌中,通過PCR篩選基因敲除突變株,結(jié)果顯示氯霉素抗性基因存在于突變株中,但是突變子仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。 本研究的開展,為阪崎克羅諾桿菌致病因子的鑒定以及致病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：1231534