本文關(guān)鍵詞：小鼠胚胎干細(xì)胞條件培養(yǎng)基促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞增殖

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【摘要】：目的： 用小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cell，，mES）條件培養(yǎng)液（conditionmedium，CM）培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞（human adipose derived stem cells，hADSC），檢測(cè)hADSC的增殖速率，試圖找到一種能夠促進(jìn)hADSC快速增殖并不影響細(xì)胞性質(zhì)的方法。 方法： hADSC提取培養(yǎng)及鑒定——hADSC分離傳代培養(yǎng)；MTT法檢測(cè)hADSC的增殖活性；hADSC的細(xì)胞表面標(biāo)記和細(xì)胞周期的流式細(xì)胞儀的檢測(cè)；成骨成脂分化能力分別用茜素紅和油紅O染色進(jìn)行鑒定。 mES未分化狀態(tài)的鑒定以及條件培養(yǎng)基的制備——mES培養(yǎng)液中添加LIF（leukemia inhibitory factor）培養(yǎng)在飼養(yǎng)層上傳代，抑制細(xì)胞分化；mES的RNA提取后用PCR鑒定其多能性因子的表達(dá)情況；收集培養(yǎng)了未分化狀態(tài)的mES24h后的培養(yǎng)液，過(guò)濾后即為CM培養(yǎng)液（condition medium）。 CM培養(yǎng)液培養(yǎng)hADSC，檢測(cè)生化分子指標(biāo)——將hADSC分為三組，分別用hADSC培養(yǎng)液、40%CM培養(yǎng)液和40%ES培養(yǎng)液來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，分為ADSC組，CM組，ES組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞表面標(biāo)記，PCR檢測(cè)hADSC的細(xì)胞特異性表達(dá)基因c-kit和sca-1的表達(dá)用來(lái)鑒定細(xì)胞性質(zhì)變化；用MTT檢測(cè)三組細(xì)胞增殖速率，三組細(xì)胞計(jì)數(shù)制備生長(zhǎng)曲線，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；Q-PCR檢測(cè)三組細(xì)胞多能性因子nanog，OCT-4的表達(dá)量；用PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因caspase-3s，Q-PCR檢測(cè)caspase-3的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3、P15代的hADSC的凋亡；用Q-PCR檢測(cè)hADSC成骨分化0d、7d、14d的ALP，collagen type I，OPN，RUNX-2的標(biāo)志基因的表達(dá)量的檢測(cè)，細(xì)胞在誘導(dǎo)21d時(shí)進(jìn)行茜素紅的染色；hADSC成脂誘導(dǎo)分化14d后進(jìn)行油紅O染色。 結(jié)果： 1.MTT結(jié)果顯示，hADSC增殖曲線呈S形，增殖情況良好；流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面因子表明CD29、CD44、CD73、CD90和CD105表面標(biāo)記陽(yáng)性表達(dá)，而CD31、CD34、CD45和HLA-DR表面標(biāo)記因子陰性表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)hADSC細(xì)胞周期表明（87.3±0.48）%的細(xì)胞處于G1期、（5.3±0.84）%的細(xì)胞處于G2期以及（7.4±0.35）%的細(xì)胞處于S期；茜素紅S染色，油紅O染色結(jié)果顯示hADSC具有向成骨和成脂分化的能力，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的基本性質(zhì)。 2.mES的細(xì)胞集落呈圓形突起狀生長(zhǎng)，球形飽滿，克隆的邊緣光滑且細(xì)胞核質(zhì)比高，有較好的折光率。其多能性基因nanog、OCT-4、sox-2高表達(dá)。收集該細(xì)胞狀態(tài)下的ES細(xì)胞培養(yǎng)24h后的培養(yǎng)液，0.22um的濾器過(guò)濾除去其中可能混有的胚胎干細(xì)胞。 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組表面標(biāo)記結(jié)果顯示，經(jīng)CM培養(yǎng)后的ADSC，其陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)志CD29，CD44，CD73，CD90，CD105表達(dá)量無(wú)變化，陰性表達(dá)的表面標(biāo)志CD31，CD45表達(dá)量降低，HLA-DR表達(dá)量增加；PCR結(jié)果顯示c-kit與Sca-1的表達(dá)量均表達(dá)，無(wú)差異；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖速率，40%CM組MTT吸光值顯著高于ADSC組（P=0.0120.05），細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示CM組的細(xì)胞增長(zhǎng)速率顯著高于其他兩組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，顯示CM組處于S期的百分?jǐn)?shù)高于其他兩組，間接顯示CM組細(xì)胞增殖速度快；Q-PCR結(jié)果顯示，OCT-4表達(dá)量，CM組，ES組表達(dá)量顯著高于ADSC組，nanog的表達(dá)，CM的表達(dá)量顯著高于ES組，ADSC組，結(jié)果表明CM培養(yǎng)液能夠增加hADSC的多能性；PCR結(jié)果顯示Caspase-3的表達(dá)量CM組顯著低于ADSC組，P=0.0030.01差異極顯著，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，顯示CM組的細(xì)胞凋亡比率低于ADSC實(shí)驗(yàn)組，說(shuō)明CM培養(yǎng)液能夠抑制hADSC凋亡；ALP及COL I的表達(dá)量，誘導(dǎo)七天時(shí)表達(dá)量最高，ALP：7d的表達(dá)量與0d、14d有顯著性差異，0d、7d、14d組間無(wú)差異。COL I：ADSC組CM組，7d與0d、14d有顯著性差異，組間無(wú)差異。OPN與RUNX-2是成骨分化晚期表達(dá)的基因，誘導(dǎo)14d的ADSC組和ES組OPN及RUNX-2的表達(dá)量顯著高于CM組。 結(jié)論： 1.胚胎干細(xì)胞條件培養(yǎng)液（ESC-CM）能夠顯著的提高h(yuǎn)ADSC的增殖速率。并不影響hADSC的細(xì)胞性質(zhì)。 2.胚胎干細(xì)胞條件培養(yǎng)液（ESC-CM）能夠增加nanog，OCT-4的基因的表達(dá)量，增加了hADSC的多能性，并且能夠抑制hADSC的凋亡。 3.在成骨成脂誘導(dǎo)分化中，成骨早期表達(dá)的基因組間沒(méi)有明顯的差異，但是晚期表達(dá)的基因如OPN，RUNX-2表達(dá)量，CM組明顯低于其他兩組。但誘導(dǎo)28d的hADSC經(jīng)過(guò)茜素紅S染色后，鈣結(jié)節(jié)數(shù)目無(wú)明顯的差異，說(shuō)明CM培養(yǎng)液增加了hADSC的原始性。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329

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1 都同功,黃冰,鐘女奇,鄧新燕,陳穎青,陳系古;不同條件下培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞[J];中國(guó)病理生理雜志;2001年02期

2 劉民,李柏青;兩種來(lái)源小鼠胚胎干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2002年02期

3 李府,沈柏均,劉星霞,侯懷水,時(shí)慶,馬秀峰;小鼠胚胎干細(xì)胞在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作用下造血相關(guān)基因表達(dá)的研究[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2004年03期

4 劉雄英,蔣寧一;小鼠胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性和體外誘導(dǎo)分化進(jìn)展[J];現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志;2004年06期

5 高巍;劉福強(qiáng);梅晰凡;劉暢;任甫;;昆明種小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定[J];遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2008年01期

6 關(guān)云謙;謝淑;孫靜敏;鄒春林;陳凌;張愚;;小鼠胚胎干細(xì)胞移植后兩種示蹤方法的比較[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2010年04期

7 馮樹(shù)梅;吳苑;駱靖峰;丁敏;李甜;張銘;;單層法誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞的成骨分化研究[J];新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年08期

8 彭紅梅,陳貴安;單細(xì)胞克隆小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2004年04期

9 李松,竇忠英,宋文剛,苗增民,高佩安,江新泉;培養(yǎng)方式對(duì)自原始生殖細(xì)胞分離克隆小鼠胚胎干細(xì)胞的影響[J];濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2005年01期

10 李府;沈柏均;劉星霞;鄭立波;侯懷水;時(shí)慶;馬秀峰;;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞的造血分化[J];中國(guó)病理生理雜志;2006年08期

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1 江海洪;向德棟;劉俊;劉國(guó)棟;王宇明;;小鼠胚胎干細(xì)胞體外分步誘導(dǎo)為肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二次全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

2 王晏鵬;陳娟;崔毓桂;劉嘉茵;;一種高效的小鼠胚胎干細(xì)胞分離方法的建立[A];江蘇省遺傳學(xué)會(huì)第七屆二次代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2008年

3 楊淋清;羅凌鳳;吳德生;龔春梅;黃海燕;周麗;楊細(xì)飛;劉建軍;莊志雄;;雙酚A對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞兩種干性因子表達(dá)水平的影響[A];2012深圳市預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2012年

4 田孝祥;韓雅玲;康建;閆承慧;齊巖梅;李娜;;小鼠胚胎干細(xì)胞來(lái)源平滑肌細(xì)胞的純化和功能研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第11次心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

5 金立方;李吉霞;包華瓊;王新莊;;昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞分離與克隆[A];全國(guó)首屆動(dòng)物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

6 孫瑩璞;孔慧娟;耿嘉暄;;小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立及影響因素探討[A];第一屆中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)、中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)生殖生物學(xué)分會(huì)聯(lián)合年會(huì)論文匯編[C];2007年

7 滕曉春;Yan-yun Liu;胡曉娜;單忠艷;滕衛(wèi)平;Gregory A.Brent;;甲狀腺激素在小鼠胚胎干細(xì)胞分化為大腦皮層錐體細(xì)胞過(guò)程中機(jī)制的探討[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十一次全國(guó)內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

8 田孝祥;韓雅玲;康建;徐凱;閆承慧;;小鼠胚胎干細(xì)胞體外分化形成新生血管的實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)第八次全國(guó)心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編[C];2006年

9 蔣永華;孫筱放;鄭育紅;張文紅;銀益飛;廖寶平;;4個(gè)品系小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立[A];第一屆中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)、中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)生殖生物學(xué)分會(huì)聯(lián)合年會(huì)論文匯編[C];2007年

10 劉元偉;郭繼鴻;張萍;周春燕;李繼文;;二甲基亞砜誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌分化過(guò)程中的毒性作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心電生理和起搏分會(huì)第八次全國(guó)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2008年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 何釗;小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)、肌肉分化的初步研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2005年

2 張華屏;尼古丁對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞特異基因表達(dá)的影響[D];四川大學(xué);2004年

3 李巖;小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為肝細(xì)胞過(guò)程中轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)變化[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

4 寧芳;誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向牙齒上皮樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

5 余樹(shù)民;小鼠胚胎干細(xì)胞建系的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

6 張佳蓉;小鼠胚胎干細(xì)胞表面蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2010年

7 諶兵來(lái);小鼠胚胎干細(xì)胞建系新方法及TFAG促進(jìn)鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的初步研究[D];中南大學(xué);2003年

8 李中偉;BMP-DUSP9-ERK信號(hào)途徑與小鼠胚胎干細(xì)胞命運(yùn)決定[D];清華大學(xué);2012年

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10 鄭筱葉;血管緊張素Ⅱ促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化成為血管平滑肌細(xì)胞的機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2012年

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1 李恩書;昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立[D];浙江理工大學(xué);2010年

2 趙賽娟;噬菌體庫(kù)篩選小鼠胚胎干細(xì)胞特異結(jié)合多肽[D];清華大學(xué);2010年

3 陳世彬;昆明小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系的優(yōu)化[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 吳娟利;體外誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞[D];浙江大學(xué);2006年

5 孔慧娟;小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立及鑒定的初步探討[D];鄭州大學(xué);2006年

6 盛利琴;小鼠胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及其與絲素材料結(jié)合的研究[D];蘇州大學(xué);2007年

7 郭玲玲;肝素和白血病抑制因子對(duì)自制無(wú)血清代用品培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的作用[D];南昌大學(xué);2012年

8 劉朝山;小鼠胚胎干細(xì)胞干性維持關(guān)鍵蛋白質(zhì)的鑒定與初步研究[D];中南大學(xué);2013年

9 李樹(shù)裕;小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立與體外誘導(dǎo)向生殖細(xì)胞分化研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2013年

10 王志勇;小鼠胚胎干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

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