本文關鍵詞：弓形蟲pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4基因疫苗的構建及動物免疫保護性的研究

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【摘要】：目的應用PCR技術體外擴增弓形蟲表面抗原SAG1和SAG4目的基因片段，構建pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4基因疫苗，分別及混合免疫小鼠后以動物的血清抗體和對弓形蟲感染的保護性為指標，評價疫苗的免疫效果，為弓形蟲病DNA疫苗應用奠定基礎。 方法提取弓形蟲RH株的基因組DNA，根據(jù)GenBank中弓形蟲RH標準株的SAG1和SAG4基因序列分別各設計一對特異性引物，通過PCR體外擴增的方法獲取目的基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、測序和BLAST同源比對分析鑒定。經(jīng)鑒定的SAG1和SAG4基因片段回收純化后連接至PEGM-T Easy載體中構建克隆重組質粒PEGM-T Easy-SAG1和PEGM-T Easy-SAG4，克隆質粒經(jīng)菌落PCR、雙酶切和測序鑒定后，分別用限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ和BamHⅠ、XbaⅠ從PEGM-T Easy-SAG1和PEGM-T Easy-SAG4中切下SAG1和SAG4基因片段，亞克隆至質粒pVAX1中，用菌落PCR、雙酶切進行鑒定。鑒定后，大量提取重組質粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4以制備基因疫苗。將制備的基因疫苗pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4分別及混合后經(jīng)后肢肌肉注入Bala/c小鼠3次，，每次間隔2W，小鼠斷尾取血，分離血清ELISA法測定弓形蟲抗體，末次免疫后2W用弓形蟲RH株速殖子攻擊，分別觀察小鼠的發(fā)病及死亡情況。 結果提取的基因組DNA用特異性引物進行PCR體外擴增后獲得SAG1基因片段長772bp，SAG4基因片段長511bp，測序后經(jīng)BLAST同源性分析顯示獲得的兩個目的片段與弓形蟲RH標準株相對應的SAG1基因和SAG4基因的cDNA同源性分別為99%和100%�？寺≈亟M質粒PEGM-TEasy-SAG1和PEGM-T Easy-SAG4經(jīng)菌落PCR和雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示在800bp和500bp處有特異性條帶，測序結果也顯示SAG1和SAG4目的基因片段已正確地插入克隆質粒T7啟動子下游，并含有HindⅢ、BamHⅠ和BamHⅠ、 XbaⅠ酶切位點。真核表達質粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4經(jīng)菌落PCR和雙酶切鑒定后瓊脂糖凝膠電泳顯示分別在800bp和500bp處得到與預期大小一致的目的基因片段條帶SAG1和SAG4。核酸疫苗pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4單價及混合多價疫苗免疫小鼠后，各組的血清抗體OD值均為陰性。攻擊實驗中混合多價疫苗比單價疫苗存活時間長，核酸單價疫苗pVAX1-SAG1比pVAX1-SAG4存活時間長，差異有統(tǒng)計學意義（p0.05）。 結論用PCR方法成功從弓形蟲RH株速殖子基因中擴增出SAG1和SAG4基因片段，構建了克隆質粒PEGM-T Easy-SAG1和PEGM-TEasy-SAG4及真核表達質粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4。pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4重組質粒能誘導動物產(chǎn)生保護性免疫力，pVAX1-SAG1單價核酸疫苗的免疫保護保護性比pVAX1-SAG4好，而兩者混合組成的多價疫苗效果則比各自的單價疫苗更理想。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R382.5

【參考文獻】

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本文編號：1203082