本文關鍵詞：抑制線粒體MPTP開放對大鼠重要器官缺血缺氧損傷的保護作用及其機制研究

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【摘要】：缺血缺氧是重要組織和器官最常見的致傷因素。創(chuàng)傷失血性休克是導致機體供血不足，組織缺血缺氧的常見原因之一。糾正休克后組織缺血缺氧的關鍵措施是恢復有效循環(huán)血量和微循環(huán)灌注，增加組織供氧�；A研究及臨床資料證實單純補液治療并不能有效恢復失血性休克患者的組織器官氧供。因此，尋求有效的抗休克措施，改善缺血組織器官的供血狀況是亟待研究和解決的問題。近年來，大量的文獻報道線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)在細胞缺血缺氧性損傷過程中發(fā)揮著重要作用，與重要組織器官的缺血再灌注損傷以及神經系統(tǒng)病變有著密切的聯(lián)系。環(huán)孢素A(cyclosporine A，CsA)可以抑制MPTP的開放，從而發(fā)揮對MPTP開放造成的組織細胞缺血性損害和氧化性損害的保護和治療作用。但抑制MPTP能否對休克缺血缺氧所致組織器官損傷有保護作用，其機制如何，目前尚不清楚。血管功能(舒張/收縮功能)障礙是嚴重創(chuàng)傷/休克等臨床重癥常出現(xiàn)的一種心血管功能障礙，它嚴重影響著組織器官灌注，進而影響這些疾病的治療。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和Rho激酶(Rho associatedserine/threonine kinase，ROCK)是重要的調節(jié)休克后血管功能的激酶分子，在休克病理過程的發(fā)展和休克治療中發(fā)揮重要作用。那么，MPTP關閉劑CsA能否通過改善休克后血管功能來改善組織灌注，發(fā)揮對器官功能的保護作用，其作用機制是否與PKC和ROCK有關，目前尚不清楚。據(jù)此，我們利用創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型，研究CsA對休克后重要器官缺血缺氧損傷的保護作用及與血管功能的關系，并從PKC和ROCK途徑初步探討其機制。主要內容包括：CsA對休克動物的整體治療效果，包括存活情況、血流動力學指標、血氣指標；CsA對休克動物重要器官的保護作用，包括肝腎血流量、肝腎功能及組織線粒體功能；CsA對休克動物血管收縮/舒張功能的影響及與PKC和ROCK的關系。 主要實驗方法： 第一部分抑制MPTP開放對大鼠缺血缺氧損傷的保護作用 采用創(chuàng)傷失血性休克模型(40mmHg，3h，伴左側股骨折斷)。動物分組情況為：正常對照組，無骨折、放血和給藥處理；休克對照組，僅休克，不復蘇；LR復蘇組，在休克末給予2倍失血量的乳酸林格氏液(LR)；LR＋CsA1、5、10mg/kg組，分別將1、5、10mg/kg的CsA加入2倍失血量的LR進行輸注。觀察動物存活時間和24h存活率。在休克前、休克末(創(chuàng)傷失血性休克3h時)、復蘇后1h、復蘇后2h，觀察大鼠血流動力學指標(MAP、HR、LVSP、LVEDP、±dp/dtmax)和血氣(pH值、BE、乳酸、HCO_3~-、PaO_2、PaCO_2、SaO_2)的變化。在上述四個時相點將大鼠行剖腹手術，采用激光多譜勒組織血流量測定儀測量肝、腎血流量，抽血檢測肝腎功能(ALT、AST、BUN、CREA)，隨后處死大鼠，取肝臟、腎臟和小腸檢測其線粒體功能。觀察MPTP抑制劑CsA對休克大鼠血流動力學、血氣、肝腎血流量、肝腎功能和線粒體功能的影響。 第二部分抑制MPTP開放對缺血缺氧血管功能的保護作用及其機制 血管環(huán)實驗，實驗分組包括正常對照組、休克對照組、LR復蘇組、CsA1mg/kg組、CsA5mg/kg組、CsA10mg/kg組、CsA5mg/kg+ROCK激動劑U46619組、CsA5mg/kg+ROCK抑制劑Y27632組、CsA5mg/kg+PKC激動劑PMA組、CsA5mg/kg+PKC抑制劑Staurosporine組。實驗模型和給藥處理方法同第一部分。在復蘇后將大鼠行剖腹手術，分離腸系膜上動脈(SMA)，利用離體血管環(huán)張力測定技術，觀察MPTP關閉劑CsA對去甲腎上腺素(NE)誘導的休克大鼠腸系膜上動脈收縮反應和對乙酰膽堿(ACh)誘導的舒張反應的影響，以及PKC和ROCK在其中的作用。 細胞實驗，采用培養(yǎng)的大鼠腸系膜動脈血管平滑肌細胞(VSMC)，觀察ROCK激動劑和抑制劑對缺氧培養(yǎng)的VSMC的MPTP開放情況的影響，結合前面實驗探討ROCK和PKC是否參與了抑制MPTP開放所介導的缺血缺氧血管功能的保護作用。 主要結果： 1.與單純乳酸林格氏液復蘇相比，CsA(5mg/kg和10mg/kg)可明顯提高創(chuàng)傷失血性休克大鼠的存活時間和24h存活率。休克處理24h后，正常對照組、休克對照組、LR組、CsA1mg/kg組、CsA5mg/kg組、CsA10mg/kg組的存活動物數(shù)分別為16/16、0/16、4/16、5/16、9/16、9/16。 2.休克后大鼠的血流動力學指標MAP、LVSP、±dp/dtmax和HR都顯著降低。LR復蘇可輕度改善血流動力學指標，但顯著低于正常對照組；CsA(5mg/kg和10mg/kg)可明顯升高MAP、LVSP和±dp/dtmax，在復蘇2h時明顯高于LR組(P0.05)，并接近正常水平；CsA1mg/kg也可使上述各項指標有所恢復，但與LR組相比無統(tǒng)計學差異。各劑量的CsA治療組與LR組對休克大鼠的HR恢復情況沒有顯著性差異。各實驗組大鼠在各時相點的LVEDP指標變化沒有統(tǒng)計學意義。 3.休克后大鼠處于嚴重的酸堿平衡失調狀態(tài)，血pH值、HCO_3~-、BE均顯著下降，乳酸含量明顯增高。不同劑量CsA輸注可改善休克后的酸中毒狀態(tài)，使血漿HCO_3~-、BE明顯恢復，乳酸水平降低，CsA5mg/kg對血氣指標的改善作用明顯優(yōu)于單純給予LR復蘇(P0.05或P0.01)。而在各時相點各實驗組大鼠的SaO_2基本均處于正常范圍，未出現(xiàn)有臨床意義的改變。 4.創(chuàng)傷失血性休克后大鼠的肝、腎血流量明顯低于正常水平，肝腎功能指標AST、ALT、BUN和CREA含量顯著升高。經過復蘇治療2h后，CsA5mg/kg組的肝血流量明顯高于休克對照組和LR組(P0.05)，各劑量CsA治療組的腎血流量均高于休克對照組和LR組(P0.05或P0.01)。CsA1、5mg/kg組的ALT和CREA指標明顯下降，低于LR組(P0.05或P0.01)。各復蘇組的AST和BUN指標在復蘇治療前后未出現(xiàn)顯著改善。 5.休克處理后，大鼠的肝、腎及小腸線粒體功能均明顯下降。經過復蘇治療2h后，CsA5mg/kg組的肝線粒體功能以及CsA1、5mg/kg組的腎、小腸線粒體功能均明顯恢復，接近正常水平，明顯高于休克對照組和LR組(P0.05或P0.01)。 6.休克損傷使大鼠腸系膜上動脈對去甲腎上腺素(NE)誘導的收縮反應和對乙酰膽堿(ACh)誘導的舒張反應都明顯降低，單用LR復蘇僅輕度提升血管收縮和舒張功能，CsA輸注可明顯恢復休克大鼠的腸系膜動脈收縮/舒張功能(P0.05或P0.01)，其中5mg/kg的CsA效果最為明顯。 7. ROCK的抑制劑Y27632可顯著抑制CsA引起的休克血管收縮反應的增加，最大收縮張力較CsA組顯著降低(P0.01)；ROCK的激動劑U46619可進一步增加CsA誘導的休克血管反應升高。PKC的激動劑PMA和抑制劑Staurosporine對CsA調節(jié)休克血管功能的作用無明顯影響。 8.缺氧處理使VSMC的MPTP開放顯著增加，ROCK的激動劑U46619處理可抑制缺氧后MPTP的開放(P0.05)，而ROCK的抑制劑Y27632處理使MPTP開放進一步增加。 結論： 1. MPTP關閉劑CsA對創(chuàng)傷失血性休克后缺血缺氧損傷有保護作用，可明顯促進休克動物的血流動力學、血氣、重要器官功能及血流量、線粒體功能的恢復，提高創(chuàng)傷失血性休克大鼠的存活率和存活時間。結果提示抑制MPTP開放有可能成為創(chuàng)傷失血性休克治療的新策略。 2.休克導致了血管的收縮/舒張功能明顯損傷，抑制MPTP可通過恢復休克后血管功能來改善組織血流灌注和器官功能，發(fā)揮對創(chuàng)傷休克的治療作用，，初步結果提示其機制可能與ROCK調節(jié)MPTP開放有關。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363

【參考文獻】

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4 胡弋;李濤;徐競;唐小唪;劉良明;;缺血預處理對失血性休克大鼠血管反應性及鈣敏感性的影響[J];中國病理生理雜志;2011年03期

本文編號：1173310