本文關(guān)鍵詞：1、丙型肝炎病毒核心蛋白通過自誘導(dǎo)方式可溶性表達(dá)及其生物學(xué)功能鑒定 2深度測序分析HBV感染中多基因型混合感染

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【摘要】：本論文分成兩部分，均是方法學(xué)研究。第一部分研究了一個(gè)新的用于蛋白表達(dá)的方法學(xué)，使以往無法表達(dá)的HCV完整核心蛋白成功地被可溶性表達(dá)，并對(duì)該蛋白進(jìn)行了生物學(xué)鑒定；第二部分研究了高通量測序在臨床基因分型中的應(yīng)用，并以此方法分析了HBV感染中的混合感染問題，證明了其普遍存在性。 第一部分：丙型肝炎病毒核心蛋白通過自誘導(dǎo)方式可溶性表達(dá)及其生物學(xué)功能鑒定 目的：構(gòu)建包含丙型肝炎病毒核心蛋白(Core protein)全長基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)型大腸桿菌后自誘導(dǎo)（Auto-induction）培養(yǎng)以獲取可溶性重組核心蛋白，并鑒定其基本的生物學(xué)功能，在細(xì)胞中表達(dá)的活性，以及與其它蛋白的相互作用。 方法：以H/FL質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增全長HCV核心蛋白DNA（573bp）。PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后通過電泳鑒定，再定向克隆到pET28a原核表達(dá)載體中。將重組的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)型大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，挑選陽性單克隆，并通過自誘導(dǎo)培養(yǎng)的方式使其在高濃度狀態(tài)下表達(dá)重組核心蛋白，并轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后表達(dá)。重組核心蛋白經(jīng)Western blot檢測鑒定生物學(xué)功能，單獨(dú)通過Ni-NTA親和層析柱純化純化，并與HCV NS3蛋白進(jìn)行相互結(jié)合后共同純化實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果：重組核心蛋白大量存在于表達(dá)菌破菌上清中。Western blot顯示其具有核心蛋白抗原性，細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白也具有相同的抗性。重組核心蛋白不能單獨(dú)通過Ni-NTA親和層析柱純化，但可以與HCVNS3蛋白結(jié)合后共同純化。 結(jié)論：自誘導(dǎo)的方式成功通過表達(dá)了可溶性的重組完整HCV核心蛋白，驗(yàn)證了細(xì)菌和細(xì)胞表達(dá)重組蛋白具有抗原性。證明了自誘導(dǎo)培養(yǎng)方式對(duì)傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方式在HCV完整核心蛋白誘導(dǎo)表達(dá)中的優(yōu)越性。重組核心蛋白結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)使其無法單獨(dú)被層析柱純化，但利用與HCVNS3蛋白存在相互作用可以使兩者共同純化。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究完整HCV核心蛋白特殊的晶體結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，為研究新的HCV臨床抗原檢測應(yīng)用開辟了道路。 第二部分：深度測序分析HBV感染中多基因型混合感染 目的：研究表明HBV基因型影響臨床結(jié)局和抗病毒治療反應(yīng)，不同基因型在HBV感染中有著不同的臨床表現(xiàn)�；蛐偷难芯恳殉蔀镠BV研究新的熱點(diǎn)，而不同基因型混合感染則使HBV感染的臨床表現(xiàn)更復(fù)雜，目前對(duì)混合感染的研究還不是很多，因此對(duì)混合感染的基因分型研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。為了全面探討基因型混合感染在HBV患者中是否普遍存在，我們采用深度測序技術(shù)，通過對(duì)大樣本HBV感染者序列的高通量測序來回答這個(gè)問題。 方法：提取共532例HBV慢性感染病人的血清DNA。其中包含218位用阿德福韋治療一年的病人治療前后的血清樣本，以及60位嬰兒的血清樣本和18對(duì)母子的血清樣本。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Solexa測序。用我們建立的HBV短序列窗口分型方法對(duì)所測序列基因分型。并用Sanger法和克隆測序重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。統(tǒng)計(jì)分析混合感染程度與病毒滴度、年齡、性別、肝功能、e抗原等之間的相關(guān)性。 結(jié)果：532例Solexa檢測標(biāo)本中基本都是兩種以上基因型混合，混合感染中劣勢基因型比例均大于0.2%，0.5%的占98%，1%的占92.2%，10%的占42.7%。母嬰和母子標(biāo)本的基因型具有很好的相關(guān)性。對(duì)其中96例樣品采用Sanger法直接測序進(jìn)行驗(yàn)證，兩種方法的結(jié)果一致。對(duì)40例Solexa測序樣品，采用克隆測序進(jìn)一步驗(yàn)證，兩種方法的結(jié)果也高度一致。對(duì)ADV治療前后出現(xiàn)基因型轉(zhuǎn)換的患者深度測序表明，患者基線時(shí)即存在混合感染，，之所以出現(xiàn)優(yōu)勢基因型的轉(zhuǎn)換，推測可能和不同基因型對(duì)藥物的反應(yīng)性相關(guān)。對(duì)基因型變化量的統(tǒng)計(jì)分析表明，C型變化量總體多于B型（P＜0.05）。 結(jié)論：混合感染普遍存在于中國大陸地區(qū),并且主要以B、C型混合為主�；旌细腥局饕缘捅壤男问酱嬖凇；旌细腥局饕ㄟ^母嬰傳播形成�；旌细腥境潭扰c病毒滴度、性別、肝功能密切相關(guān)。上述研究方法對(duì)于其它病毒不同基因型或亞型間混合感染具有重要指導(dǎo)和借鑒意義。至于混合感染為何普遍存在于中國大陸地區(qū)HBV攜帶者中的原因，目前還不清楚，混合感染與疾病轉(zhuǎn)歸及抗病毒療效的關(guān)系也有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.63;R3416

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1166254