本文關(guān)鍵詞：HDAC5在小鼠胚胎干細(xì)胞胚層分化以及體細(xì)胞重編程中的作用

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【摘要】：在再生醫(yī)學(xué)中，人們可以通過(guò)移植自體或配型相符的異體干細(xì)胞的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)修復(fù)、替代或再生受損或病變的細(xì)胞、組織和器官。另外產(chǎn)生于體細(xì)胞重編程的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells）也為干細(xì)胞的替代治療,疾病發(fā)病機(jī)制的研究和新藥的測(cè)試提供了另外一種潛在的資源，同時(shí)還可以規(guī)避用胚胎干細(xì)胞研究所涉及的倫理問(wèn)題。 胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells, ES cells）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞因在模擬及治療人類疾病方面的重大研究意義和廣闊的應(yīng)用前景而成為近年的研究熱點(diǎn)。越來(lái)越多的研究表明，表觀遺傳學(xué)修飾對(duì)胚胎干細(xì)胞多能性狀態(tài)的維持、細(xì)胞譜系特異性的決定以及體細(xì)胞的重編程都起著至關(guān)重要的作用。而且表觀遺傳學(xué)中的組蛋白修飾可以控制基因的轉(zhuǎn)錄激活與抑制，其中乙酰化是最為重要的修飾方式之一。一般來(lái)說(shuō)，核心組蛋白的乙�；皆龈吲c轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)，反之則與抑制相關(guān)。而維持核心組蛋白乙酰化水平的穩(wěn)定有賴于組蛋白乙�；福╤istone acetylases, HATs）和去乙酰化酶（histone deacetylases, HDACs）活性的平衡。 HDACs作為維持組蛋白乙酰化平衡的關(guān)鍵酶，憑借其轉(zhuǎn)錄抑制作用在介導(dǎo)一系列諸如：生長(zhǎng)，死亡，分化，發(fā)育以及免疫反應(yīng)等生物學(xué)事件中起著非常重要的作用。根據(jù)與酵母去乙酰化酶的同源性關(guān)系，HDACs被分成4個(gè)不同的家族。其中II類HDACs因其表達(dá)的組織特異性，而可能參與組織細(xì)胞的分化和發(fā)育，多項(xiàng)研究表明該家族成員HDAC5可在肌細(xì)胞分化、心肌發(fā)育、血管生成以及免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。 研究目的： 既然HDAC5參與到細(xì)胞的分化以及發(fā)育的調(diào)控，那么在胚胎發(fā)育的早期，HDAC5是否就已經(jīng)參與相關(guān)調(diào)控了呢？由于ES細(xì)胞是對(duì)應(yīng)于體內(nèi)早期胚胎置入后的外胚層細(xì)胞，其分化模擬許多與胚胎發(fā)育有關(guān)的事件。因此通過(guò)探討HDAC5在ES細(xì)胞多能性狀態(tài)的維持以及分化中所起的作用，可以更深入地了解胚胎發(fā)育早期所涉及的一些分子調(diào)控機(jī)制，為干細(xì)胞的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。 另外，iPS細(xì)胞因與ES細(xì)胞的生物學(xué)相似性，而有望成為ES細(xì)胞很好的替代物。但是通過(guò)體細(xì)胞重編程產(chǎn)生iPS細(xì)胞的過(guò)程需要消除體細(xì)胞固有的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記并建立新的針對(duì)干細(xì)胞特征的標(biāo)記,因此通過(guò)探究HDAC5在小鼠體細(xì)胞重編程中所起的作用，為早日解決重編程中所面臨的問(wèn)題提供一些新的思路。 因此本研究分為兩個(gè)部分，分別探討HDAC5在ES細(xì)胞多能性維持、胚層分化以及體細(xì)胞重編程中的作用。 研究方法： 1.檢測(cè)HDAC5對(duì)小鼠ES細(xì)胞自我更新的影響 本部分采用小鼠ES-E14TG2a胚胎干細(xì)胞系作為研究模型，首先分別建立HDAC5穩(wěn)定下調(diào)和過(guò)表達(dá)的小鼠ES細(xì)胞系，然后通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，ALP)染色、多能性相關(guān)基因的檢測(cè)和克隆形成能力的評(píng)估來(lái)評(píng)價(jià)HDAC5對(duì)ES細(xì)胞自我更新能力的影響。 2.檢測(cè)HDAC5對(duì)小鼠ES細(xì)胞胚層分化的影響 分別將下調(diào)和上調(diào)HDAC5的小鼠ES細(xì)胞系進(jìn)行體外分化（自發(fā)分化形成擬胚體）和體內(nèi)分化（自發(fā)分化形成畸胎瘤），并通過(guò)檢測(cè)相關(guān)胚層標(biāo)志基因的表達(dá)和觀察胚層分化的組織形態(tài)來(lái)評(píng)價(jià)HDAC5對(duì)小鼠ES細(xì)胞胚層分化的影響。 3.明確HDAC5在小鼠體細(xì)胞重編程中的作用 采用Yamanaka四因子誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）重編程的經(jīng)典方法，并在誘導(dǎo)起始階段加入HDAC5的shRNA的策略，在誘導(dǎo)結(jié)束后檢測(cè)形成iPS細(xì)胞的效率從而判斷HDAC5對(duì)重編程的影響。 4.檢測(cè)HDAC5對(duì)體細(xì)胞重編程中MET期的影響 通過(guò)下調(diào)HDAC5后檢測(cè)MET（Mesenchymal-to-Epithelial Transition，間質(zhì)—上皮樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化）期標(biāo)志性基因的表達(dá)變化，從而揭示HDAC5參與重編程調(diào)控的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1. HDAC5對(duì)小鼠ES細(xì)胞自我更新的影響 不管是下調(diào)或是上調(diào)HDAC5的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶染色，多能性相關(guān)基因表達(dá)以及克隆形成能力方面都沒(méi)有差異。 2. HDAC5對(duì)小鼠ES細(xì)胞胚層分化的影響 通過(guò)體內(nèi)外分化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：下調(diào)HDAC5促進(jìn)小鼠ES細(xì)胞向中胚層分化，同時(shí)抑制其向外胚層的分化，而內(nèi)胚層不受影響；相反，上調(diào)HDAC5促進(jìn)外胚層分化的同時(shí)抑制中胚層的分化，內(nèi)胚層仍然不受影響。 3. HDAC5在小鼠體細(xì)胞重編程中的作用 重編程結(jié)束后通過(guò)計(jì)數(shù)堿性磷酸酶染色陽(yáng)性和GFP陽(yáng)性的克隆發(fā)現(xiàn)：下調(diào)HDAC5后嚴(yán)重影響重編程的效率。 4. HDAC5對(duì)體細(xì)胞重編程過(guò)程中MET的影響 檢測(cè)MET期標(biāo)志基因的表達(dá)表明：下調(diào)HDAC5后上皮樣標(biāo)志基因的表達(dá)受到抑制，，而間質(zhì)樣標(biāo)志基因則處于異常激活狀態(tài)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 1. HDAC5不影響小鼠ES細(xì)胞自我更新的維持。 2. HDAC5的表達(dá)變化影響小鼠ES細(xì)胞的胚層分化。 3. HDAC5是小鼠體細(xì)胞重編程所必需的關(guān)鍵調(diào)控因子。 4. HDAC5通過(guò)影響MET參與體細(xì)胞重編程的調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R321

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Chia-Lin Wei;;Tackling the epigenome in the pluripotent stem cells[J];遺傳學(xué)報(bào);2008年07期

本文編號(hào)：1165369