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下調(diào)CD151對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性影響的初步研究

發(fā)布時(shí)間:2017-10-28 09:27

  本文關(guān)鍵詞:下調(diào)CD151對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性影響的初步研究


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【摘要】:背景:間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是多能成體干細(xì)胞的一種,起源于中胚層、可高度自我更新、且有多向分化潛能,廣泛存在于全身組織如骨髓、臍血、臍帶、絨毛膜、胎盤等,能在體外培養(yǎng)擴(kuò)增,并能在體外特定誘導(dǎo)條件下分化成為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等,MSCs獨(dú)特的生物學(xué)特性是其具有廣闊實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用的前提條件。4跨膜蛋白家族(TetraspaninSuper Family,TM4SF)是小分子糖蛋白中一員,4次跨細(xì)胞膜。不同種類的4跨膜蛋白或與其它跨膜蛋白在4跨膜蛋白密集微區(qū)(tetraspanin-enrichedmicrodomains,TEM)可以相互耦聯(lián)成復(fù)合體,正是這個(gè)復(fù)合體結(jié)構(gòu)使其具有重要生物學(xué)功能。CD151是四跨膜蛋白家族的重要成員之一,首次在血小板內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞粘附,遷移,增殖,活化,腫瘤細(xì)胞生長,轉(zhuǎn)移和成血管中起到關(guān)鍵作用。 目的:本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-derived MSCs,UC-MSCs)幾乎100%表達(dá)CD151,但到目前為止CD151對于UC-MSCs的生物學(xué)特性有何影響,尚無深入的報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)就基于此實(shí)驗(yàn)結(jié)果開展。siRNA(smallinterference RNA)干擾UC-MSCs表面CD151,使UC-MSCs CD151表達(dá)下降。比較干擾后UC-MSCs生物學(xué)特性變化(如干細(xì)胞表面標(biāo)記、誘導(dǎo)成脂、成骨分化能力),并初步檢測其對UC-MSCs免疫調(diào)節(jié)、造血支持的影響。 方法:(1)采用膠原酶消化法分離出臍帶組織的原代細(xì)胞,貼壁培養(yǎng)純化方法傳代細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測相關(guān)干細(xì)胞表面標(biāo)記,,體外成脂、成骨誘導(dǎo)分化。(2)siRNA干擾UC-MSCs表面CD151,實(shí)驗(yàn)分為3組,實(shí)驗(yàn)組(siRNA-CD151group):siRNA干擾UC-MSCs CD151;陰性對照組(siRNA-NC group):siRNA干擾UC-MSCs非特異序列;空白對照組(Blank group):不使用siRNA干擾UC-MSCs。24h、48h、72h后流式細(xì)胞儀分別檢測干擾效率,篩選最佳干擾時(shí)間后實(shí)時(shí)定量PCR檢測CD151mRNA表達(dá)情況;成脂、成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基比較3組細(xì)胞分化潛能;檢測相關(guān)干細(xì)胞表型變化。(3)植物血凝素(PHA)刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)后分別與3組細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測上清中γ-干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)水平;Real-time PCR檢測3組細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)因子如HGF、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX-2)、人吲哚胺2,3-過氧化酶(indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)mRNA水平。(4)免疫磁珠(MACS)分選臍血CD34+細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測分選效率,收集上述各組細(xì)胞條件培養(yǎng)基與CD34+細(xì)胞共培養(yǎng),于第7d、14d、21d分別觀察造血集落形態(tài)及統(tǒng)計(jì)造血集落總數(shù)。 結(jié)果: 1.分離臍帶組織,培養(yǎng)UC-MSCs 酶消化所得的原代細(xì)胞符合干細(xì)胞形態(tài)特征,表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記,可誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞; 2.siRNA干擾UC-MSCs細(xì)胞表面CD-151 (1)siRNA干擾72h為最佳干擾時(shí)間,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜表面CD151表達(dá)水平(11.97±2.63%)與對照組(95.66±1.56%)、空白組(95.48±4.04%)相比明顯下降(P0.05,P0.05),實(shí)驗(yàn)組CD151mRNA表達(dá)水平與對照組、空白組相比下調(diào)均為7.7倍,差異明顯降低(P0.01,P0.01); (2)3組細(xì)胞貼壁生長,均為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài);流式細(xì)胞儀均可檢測到3組細(xì)胞表面CD73、CD90、CD105和HLA-ABC;未檢測到CD34、CD45:其中實(shí)驗(yàn)組CD105表達(dá)水平(83.37±0.71%)與對照組(93.66±0.21%)、空白組(91.87±0.75%)相比顯著下降(P0.05,P0.05); (3)在不同分化培養(yǎng)基狀態(tài)下,盡管3組細(xì)胞均可向成骨、脂肪細(xì)胞分化:但是實(shí)驗(yàn)組脂滴與對照組、空白組相比無明顯差異;而實(shí)驗(yàn)組中鈣鹽沉積體積減小,數(shù)量增加; 3.干擾CD-151后,對UC-MSCs免疫調(diào)節(jié)作用的影響 (1)PBMC,PHA與干擾后UC-MSCs細(xì)胞共培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組上清中IFN-γ水平與對照組、空白組相比顯著上升(P0.05,P0.05)。 (2)實(shí)驗(yàn)組中HGF、TGFβ-1的mRNA表達(dá)量相比于對照組和空白組,均明顯降低(P0.01,P0.01)、COX-2mRNA升高(P0.05)、IDO無差異;ELISA檢測實(shí)驗(yàn)組HGF分泌量亦同樣下降(P0.01); 4.干擾CD-151后,對UC-MSCs造血支持作用的影響 實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞條件培養(yǎng)基均能形成造血集落,包括粒系集落形成單位(Colony forming unit-granulocyte,CFU-G)、粒-巨噬集落形成單位(Colony formingunit-granulocyte and macrophage,CFU-GM)、巨噬系集落形成單位(Colony formingunit-macrophage,CFU-M),未觀察到紅細(xì)胞系集落形成單位(Colony formingunit-erythroid, CFU-E),集落體積較小,散在分布,數(shù)量較少,出現(xiàn)時(shí)間較晚,各組細(xì)胞間集落總數(shù)無差異;上述各種集落形成單位在陽性培養(yǎng)基中均可見;siRNA干擾UC-MSCs72h的條件培養(yǎng)基仍然具有促使CD34+細(xì)胞分化的作用,具備造血支持能力,CD34+細(xì)胞朝髓細(xì)胞系分化而不朝紅細(xì)胞分化。 結(jié)論: 1.siRNA-CD151作用72h后可成功下調(diào)UC-MSC CD151mRNA表達(dá),干擾CD151后UC-MSC仍保持干細(xì)胞表面標(biāo)記,體外誘導(dǎo)成脂肪分化無明顯變化,但可影響其成骨誘導(dǎo)分化能力; 2.siRNA-CD151能降低UC-MSC抑制PBMC分泌γ-干擾素的能力,其機(jī)制可能是通過相關(guān)可溶性免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá)改變從而影響其免疫調(diào)節(jié)作用; 3.siRNA干擾后細(xì)胞條件培養(yǎng)基仍然具有促使CD34+細(xì)胞分化的作用,具備造血支持能力,但2組細(xì)胞間集落總數(shù)無差異,表明CD151可能不是UC-MSC發(fā)揮造血支持作用的主要分子。
【關(guān)鍵詞】:CD151 小干擾RNA 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 生物學(xué)特性 免疫調(diào)節(jié) 造血支持
【學(xué)位授予單位】:暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2013
【分類號】:R329
【目錄】:
  • 中文摘要3-6
  • Abstract6-10
  • 目錄10-11
  • 第一部分 前言11-19
  • 1.1 干細(xì)胞簡述11-15
  • 1.1.1 MSCs 的多向分化潛能11-12
  • 1.1.2 MSCs 的免疫調(diào)節(jié)作用12-14
  • 1.1.3 MSCs 的造血支持作用14-15
  • 1.1.4 UC-MSCs 的特點(diǎn)15
  • 1.2 CD151 概述15-18
  • 1.2.1 CD151 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)16
  • 1.2.2 CD151 的組織分布16
  • 1.2.3 CD151 與整合素16-17
  • 1.2.4 CD151 的功能17-18
  • 1.3 本研究的內(nèi)容及意義18-19
  • 第二部分 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線19-21
  • 2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定19
  • 2.2 RNAi MSCs 表面 CD151 及檢測干擾效率19-20
  • 2.3 干擾 CD151 MSCs 對免疫調(diào)節(jié)的影響20
  • 2.4 干擾 CD151 MSCs 對造血支持的影響20-21
  • 第三部分 材料、試劑與儀器21-24
  • 3.1 材料21
  • 3.2 主要試劑21-22
  • 3.3 主要儀器22-23
  • 3.4 主要溶液配制23-24
  • 第四部分 實(shí)驗(yàn)方法24-33
  • 第五部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-45
  • 5.1 UC-MSC 的生物學(xué)特性33-34
  • 5.2 siRNA 干擾 UC-MSC34-39
  • 5.3 干擾后對免疫調(diào)節(jié)影響39-42
  • 5.4 干擾后對造血支持的影響42-44
  • 實(shí)驗(yàn)結(jié)果小結(jié)44-45
  • 第六部分 討論、存在的問題及不足45-50
  • 結(jié)論50-51
  • 參考文獻(xiàn)51-56
  • 附錄一 主要溶液配置56-57
  • 附錄二 英文縮略圖表57-59
  • 附錄三 在校期間發(fā)表論文情況59
  • 附錄四 在校期間參加的學(xué)術(shù)會議59-60
  • 致謝60

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 房佰俊,韓欽,楊少光,趙春華;TGF-β1對成人骨髓CD105~+間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年03期

2 王小娜;李正;王tR;蘭愛平;吳文;;TGF-β_1在雷奈酸鍶促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化中的作用[J];中國病理生理雜志;2011年12期

3 李麗娜;韓之波;王有為;羅偉峰;及月茹;楊舟鑫;馮莉;戚仁斌;李揚(yáng)秋;韓忠朝;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基體外支持造血的功能[J];中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2012年04期



本文編號:1107674

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