本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用大塊平鋪法對人臍帶間充質(zhì)干細胞分離、傳代、凍存及復(fù)蘇的研究

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【摘要】：目的：應(yīng)用四種不同的培養(yǎng)方法進行人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、傳代、凍存、復(fù)蘇，比較各方法之間優(yōu)劣,探索并建立一種簡單、實用的人臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)方法，為再生醫(yī)學(xué)以及實驗研究提供新的培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞的方法。 方法：分別以1大塊平鋪法；2傳統(tǒng)組織塊法；3膠原酶Ⅳ消化法；4.膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法，四種不同的方法對臍帶間充質(zhì)干細胞進行細胞分離、培養(yǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇。鏡下觀察細胞形態(tài)，記錄各組細胞首次融合時間、各組成功率，并以臺盼藍染色法測定細胞活性，以第3代細胞應(yīng)用流式細胞術(shù)鑒定細胞免疫表型。 結(jié)果：1細胞形態(tài)：鏡下可見貼壁細胞呈長梭形，無序生長，可呈渦旋狀生長。2免疫表型鑒定：應(yīng)用流式細胞術(shù)對大塊平鋪法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細胞進行免疫表型鑒定。結(jié)果顯示：CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均為陽性表達，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均為陰性表達。3統(tǒng)計結(jié)果分析(由于膠原酶Ⅳ消化法無一例成功，則不做分析)。3.1首次融合時間：大塊平鋪法(17.81±0.85d)明顯早于傳統(tǒng)組織塊法(24.89±0.97d)，差異有顯著性（P＜0.05），但明顯晚于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法(7.35±0.61d)，，差異有顯著性（P＜0.05）。3.2穩(wěn)定傳代：大塊平鋪法(11.08±0.74代)與傳統(tǒng)組織塊法(11.04±0.77代)無明顯差別，差異無顯著性（P＞0.05），但明顯長于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法(6.82±0.64代)，差異有顯著性（P＜0.05）。3.3細胞活性：大塊平鋪法(90.84±0.83%)與傳統(tǒng)組織塊法(90.67±0.88%)無明顯差別，不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法(75.06±0.90%)，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。3.4成功率：大塊平鋪法與傳統(tǒng)組織塊法差異無顯著性（P＞0.0167），但明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法，差異有顯著性（P＜0.0167）。 結(jié)論：1臍帶華通膠組織是人間充質(zhì)干細胞的重要來源。2應(yīng)用大塊平鋪法、傳統(tǒng)組織塊法以及膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法三種方法可成功培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞，而應(yīng)用膠原酶Ⅳ消化法則很難成功培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞，原因在于華通膠組織中含有大量的透明質(zhì)酸，單用膠原酶Ⅳ很難消化完全，需添加透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化方可行。3鏡下可見人臍帶間充質(zhì)干細胞呈長梭形貼壁生長，可呈無序生長，呈渦旋狀生長。4大塊平鋪法、傳統(tǒng)組織塊法以及膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細胞均可穩(wěn)定傳代、凍存、復(fù)蘇，復(fù)蘇后細胞增殖穩(wěn)定。5大塊平鋪法實驗操作上省去了剪碎以及鋪塊等最為繁瑣的過程，比傳統(tǒng)組織塊法更為簡便，而以往研究表明，酶消化法操作繁瑣，不如傳統(tǒng)組織塊法簡單。膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法是酶消化法的一種，同樣操作繁瑣，大塊平鋪法操作明顯較膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法簡單，且原代培養(yǎng)獲得MSCs的時間要短于傳統(tǒng)組織塊法，提高了獲得人臍帶間充質(zhì)干細胞的效率；以往研究表明，傳統(tǒng)組織塊法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細胞細胞活性要優(yōu)于酶消化法，而大塊平鋪法細胞活性與傳統(tǒng)組織塊法無差別，明顯優(yōu)于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法；大塊平鋪法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞的成功率與傳統(tǒng)組織塊法無差別，且明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化法。6應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測大塊平鋪法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細胞免疫表型表明：CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均為陽性表達，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均為陰性表達，符合間充質(zhì)干細胞的免疫表型。 因此大塊平鋪法是一種簡單、實用的原代培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞的方法,本研究為再生醫(yī)學(xué)以及實驗研究提供了一種新的培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞的方法。
【關(guān)鍵詞】：人臍帶間充質(zhì)干細胞 培養(yǎng) 大塊平鋪法 簡單實用 流式細胞術(shù)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 前言9-10
• 材料與方法10-15
• 結(jié)果15-17
• 附圖17-23
• 附表23-24
• 討論24-27
• 結(jié)論27-28
• 參考文獻28-32
• 綜述 人間充質(zhì)干細胞的特性、臨床應(yīng)用及前景32-42
• 參考文獻37-42
• 致謝42-43
• 個人簡歷43

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 湯天軍;楊波;楊漢東;張有順;胡禮儀;李東鋒;張繼紅;;人臍帶血間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)分化為心肌細胞的實驗研究[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2005年21期

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3 何培根,余正堂;體外用條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細胞分化成心肌細胞的實驗研究[J];鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2002年04期

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5 陳宇;張寧坤;楊明;沈燕華;王麗華;高連如;;臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2010年16期

本文編號：1093076