本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲RH株ROP18基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

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【摘要】：目的 PCR擴(kuò)增剛地弓形蟲(Toxplasma gondii)棒狀體蛋白18(ROP18)基因,構(gòu)建真核表達(dá)載體pVAX1-ROP18,并檢驗(yàn)其在真核細(xì)胞中的表達(dá)。方法 ROP18基因和質(zhì)粒pVAX1分別經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切,在T4連接酶作用下連接過夜,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌E.coil XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pVAX1-ROP18轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞內(nèi)。試驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組和pVAX1空質(zhì)粒對(duì)照。提取各組HeLa細(xì)胞的總RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,分別進(jìn)行管家基因β-actin和ROP18基因的RT-PCR擴(kuò)增;采用Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞ROP18蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),ROP18基因的RT-PCR擴(kuò)增片段大小為1 665bp,與預(yù)期值相符;ROP18基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,大小為1 665bp,與預(yù)期值相符;雙酶切重組質(zhì)粒得到預(yù)期酶切片段;重組質(zhì)粒的目的基因序列與弓形蟲RH株ROP18基因(登錄號(hào)AM075204.1)序列比對(duì)完全一致。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后各組β-actin的RT-PCR擴(kuò)增目的片段均為613bp,與預(yù)期值相符;pVAX1-ROP18重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的ROP18的RT-PCR擴(kuò)增目的片段大小為1 665bp,而其他組無(wú)該目的基因條帶。Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒pVAX1-ROP18能夠在HeLa細(xì)胞內(nèi)表達(dá)ROP18蛋白。結(jié)論成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pVAX1-ROP18,且該重組質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)ROP18蛋白。
【作者單位】： 河北北方學(xué)院病原生物與免疫學(xué)研究所;
【關(guān)鍵詞】： 剛地弓形蟲 棒狀體蛋白 重組質(zhì)粒 真核表達(dá)
【基金】：河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.H2013405091) 河北北方學(xué)院校級(jí)重大課題(No.ZD201312)
【分類號(hào)】：R382.5
【正文快照】： ***剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)具有廣泛的宿主群,可引起弓形蟲病[1]。在多數(shù)情況下,弓形蟲感染呈隱性感染;在免疫力低下時(shí)可呈急性感染而出現(xiàn)嚴(yán)重異常[2-3]。妊娠期感染弓形蟲可引起流產(chǎn),死胎等[4-6]。目前,弓形蟲病的防治措施多局限于藥物治療,療效差。弓形蟲疫苗的研究

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4 孔t，

本文編號(hào)：1060411